目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1和2（h OCTN1/h OCTN2）的細(xì)胞模型;考察抗精神病藥物WY-01與h OCTN1和h OCTN2的相互作用,以及有機(jī)陽離子類轉(zhuǎn)運(yùn)體在WY-01腎臟跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。方法:（1）從人腎組織中提取h OCTN1和h OCTN2基因,構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pc DNA3.1（+）-h OCTN1和pc DNA3.1（+）-h OCTN2,分別轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,經(jīng)G418抗性篩選挑取單克隆細(xì)胞株。經(jīng)麥角硫因（h OCTN1經(jīng)典底物）或米屈肼（h OCTN2經(jīng)典底物）的細(xì)胞積聚研究,得到高活性的MDCK-h OCTN1和MDCK-h OCTN2單克隆細(xì)胞。（2）應(yīng)用MDCK-h OCTN1和MDCK-h OCTN2細(xì)胞模型,考察WY-01對h OCTN1和h OCTN2的抑制作用,并進(jìn)一步考察WY-01是否為h OCTN1或h OCTN2的底物。（3）應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)人有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（h OCT2）、人多藥及毒素外排轉(zhuǎn)運(yùn)體1和2K（h MATE1、h MATE2-K）及瞬轉(zhuǎn)人小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體2（h PEPT2）的細(xì)胞模型,進(jìn)行細(xì)胞積聚研究,考察WY-0... 

【文章來源】：浙江工業(yè)大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：103 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
第一章 轉(zhuǎn)運(yùn)體OCTN1/2 和WY-01的研究進(jìn)展
    1.1 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體與OCTN1/2 概述
    1.2 OCTN1/2 分子特征與組織分布
    1.3 OCTN1/2 底物及功能特征
        1.3.1 OCTN1生理底物麥角硫因
        1.3.2 OCTN2生理底物左旋肉堿
        1.3.3 OCTN1/2 非生理底物
    1.4 OCTN1/2 臨床相關(guān)疾病
    1.5 腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體與藥物的相互作用
        1.5.1 轉(zhuǎn)運(yùn)體參與藥物的腎臟處置
        1.5.2 腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體的分布與作用
    1.6 WY-01的研究進(jìn)展
        1.6.1 WY-01的治療作用和副作用
        1.6.2 WY-01的藥代動(dòng)力學(xué)
        1.6.3 WY-01與轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究現(xiàn)狀
    1.7 本課題研究內(nèi)容
第二章 穩(wěn)定表達(dá)hOCTN1/2 細(xì)胞模型的構(gòu)建
    2.1 儀器與材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.2 試劑與藥品
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 hOCTN1/2 基因制備
        2.2.2 pcDNA3.1（+）-hOCTN1/2質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.3 MDCK細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
        2.2.4 MDCK-hOCTN1/2單克隆細(xì)胞株功能鑒定
        2.2.5 Real-Time PCR檢測mRNA表達(dá)
        2.2.6 MDCK-hOCTN1/2 細(xì)胞積聚經(jīng)典底物的功能研究
        2.2.7 數(shù)據(jù)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 h OCTN1/2 基因制備
        2.3.2 pc DNA3.1（+）-h OCTN1/2 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.3 MDCK-h OCTN1/2 單克隆細(xì)胞功能鑒定
        2.3.4 Real-Time PCR檢測m RNA表達(dá)
        2.3.5 MDCK-h OCTN1/2 細(xì)胞的積聚功能研究
    2.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)
    2.5 實(shí)驗(yàn)討論
        2.5.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞
        2.5.2 MDCK-hOCTN2單克隆株篩選的底物選擇
        2.5.3 hOCTN1/2 轉(zhuǎn)運(yùn)特征
第三章 hOCTN1/2 與WY-01的相互作用研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 試劑與藥品
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 WY-01對MDCK-hOCTN1/2 細(xì)胞攝取底物的抑制作用
        3.2.2 WY-01的LC-MS/MS分析方法
        3.2.3 WY-01在MDCK-h OCTN1/2 細(xì)胞上的積聚
        3.2.4 樣品處理
        3.2.5 WY-01在MDCK-hOCTN1/2 細(xì)胞上的積聚
        3.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 細(xì)胞基質(zhì)中WY-01 LC-MS/MS方法的建立與驗(yàn)證
        3.3.2 WY-01對hOCTN1/2 的抑制
        3.3.3 WY-01是hOCTN1/2 的底物
        3.3.4 時(shí)間和pH對WY-01積聚的影響
        3.3.5 WY-01在MDCK-h OCTN1/2 細(xì)胞上的積聚動(dòng)力學(xué)
    3.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)
    3.5 實(shí)驗(yàn)討論
第四章 WY-01與腎臟陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        4.1.1 儀器
        4.1.2 試劑與藥品
        4.1.3 常用試劑配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 MDCK-hOCT2細(xì)胞對WY-01的攝取
        4.2.2 MDCK-hMATE1/2-K細(xì)胞對WY-01的攝取
        4.2.3 WY-01在CHO-hPEPT2細(xì)胞中的積聚
        4.2.4 樣品檢測方法
        4.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 細(xì)胞模型功能驗(yàn)證
        4.3.2 WY-01與hOCT2的相互作用
        4.3.3 WY-01與hMATE1、hMATE2-K的相互作用
        4.3.4 WY-01與hPEPT2的相互作用
    4.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)
    4.5 實(shí)驗(yàn)討論
        4.5.1 腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體與WY-01的相互作用
        4.5.2 WY-01對生理物質(zhì)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
創(chuàng)新性
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]穩(wěn)定表達(dá)hMATE1及共表達(dá)hMATE1與hOCT1或hOCT2細(xì)胞模型的構(gòu)建[J]. 雷紅梅,孫思源,李麗萍,涂美娟,周慧,曾蘇,蔣惠娣.  藥學(xué)學(xué)報(bào). 2015(07)



本文編號：3117083