發(fā)布時(shí)間：2021-02-23 11:24

　　目的:在過去的幾十年間,許多腫瘤表觀遺傳學(xué)研究表明,異常的組蛋白修飾是腫瘤發(fā)生發(fā)展的動(dòng)力。組蛋白乙�；潜碛^遺傳學(xué)中一類至關(guān)重要的翻譯后修飾,不僅在基因轉(zhuǎn)錄和染色體形成中扮演重要角色,更是與多種腫瘤疾病密切相關(guān)。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）結(jié)合蛋白（CBP）和腺病毒E1A結(jié)合蛋白（P300）是兩種密切相關(guān)的多功能轉(zhuǎn)錄輔助激活因子。這兩種蛋白都包含有一個(gè)毗鄰乙�；呋Y(jié)構(gòu)域（HAT domain）的溴域（Bromodomain）,該溴域是非BET家族溴域的重要成員之一。大量研究發(fā)現(xiàn),CBP bromodomain是一個(gè)非常有前景的治療多種癌癥和免疫調(diào)節(jié)疾病的藥物靶點(diǎn)。然而,靶向非BET家族溴域的小分子抑制劑卻非常匱乏。方法:在本文中,我們對(duì)CBP bromodomain和乙�；疕4多肽這對(duì)互作蛋白建立并優(yōu)化了基于HTRF技術(shù)的高通量篩選平臺(tái),并對(duì)實(shí)驗(yàn)室自建的化合物庫進(jìn)行高通量篩選。我們采用表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)來測(cè)定CBP bromodomain的K_D值,利用分子對(duì)接分析結(jié)合模式,測(cè)定DC_CP20衍生物的活性,分析了構(gòu)效關(guān)系。隨后,我們測(cè)... 

【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

3CBPbromodomain部分現(xiàn)有抑制劑結(jié)構(gòu)

CBPbromodomain 是組蛋白乙�；摹白x碼器”（reader）,其相互作用的底物以是組蛋白，也可以是 p53 等非組蛋白。溴域蛋白進(jìn)行藥物篩選，可以采用虛篩選（virtual screening，VS）和高通量篩選兩種篩選方法。如圖 1.1.6 所示，慮到虛擬篩選的特異性比較差，再根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，我們擇組蛋白 H4 Kac 5/8/12/16 的四乙�；嚯腫N-C:SGRG-K(Ac)-GG-K(Ac)-LG-K(Ac)-GGA-K(Ac)-RHRKVGG-K(biotin)]作為其相互作用的底物，對(duì) CBPomodomain 進(jìn)行高通量篩選。由于 CBP bromodomain 蛋白分子量比較小，我選擇適合表達(dá)小分子量蛋白、操作簡(jiǎn)便的大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)蛋白。到蛋白后，可以先做個(gè)蛋白熱遷移實(shí)驗(yàn)，加現(xiàn)有的陽性抑制劑作對(duì)照，驗(yàn)證蛋的可靠性。確定蛋白沒有問題后，我們需要摸索實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定窗口值以及達(dá)到這窗口所需要的蛋白和多肽的濃度和加樣體積。確定上述條件后，再檢測(cè)實(shí)驗(yàn)體下的 DMSO 耐受程度以及評(píng)價(jià)大通量下實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定可靠性。在各種可能影響通量結(jié)果穩(wěn)定性的因素考慮并減小后，再將篩選所需的各類試劑和耗材準(zhǔn)備全。最后，調(diào)試儀器，確定篩選比例，計(jì)算所需的化合物量，稀釋好化合物，備加樣測(cè)板讀數(shù)。

18圖 2.2.1CBPbromodomain 的質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白純化 （A）線性化 pGEX-6p-1 載體與modomain 基因片段的 1%瓊脂糖凝膠電泳圖，1、2 泳道為 pGEX-6p-1 空載，3-8 泳雙酶切線性化后，9-12 為目的基因片段；（B）GST 柱與 Superdex75 分子篩純化后 E 凝膠電泳圖，1-5 泳道為 GST 柱純化后樣品，6、7 為 Superdex75 分子篩純化后樣）GST 柱純化紫外監(jiān)測(cè)傳感圖；（D）Superdex75 分子篩凝膠層析紫外監(jiān)測(cè)傳感圖


本文編號(hào)：3047507