最近在理解癌癥和代謝之間關(guān)系方面的研究,突出了由三個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)組成的絲氨酸合成途徑（SSP）的重要性。人源3-磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH）催化SSP合成葡萄糖衍生絲氨酸的第一步,并且在多種癌細(xì)胞中顯示高表達(dá),包括乳腺癌,黑色素瘤,結(jié)腸癌,膠質(zhì)瘤,鼻咽癌等。本研究應(yīng)用基于酶活性的高通量篩選技術(shù),從不同來源的天然產(chǎn)物中篩選得到靶向PHGDH的先導(dǎo)化合物,并進(jìn)一步在細(xì)胞及動(dòng)物水平測(cè)定其活性,建立了靶向PHGDH的天然產(chǎn)物（NP）抑制劑的篩選和活性評(píng)價(jià)體系。Azacoccone E,一種來自黃曲霉培養(yǎng)物的次生代謝產(chǎn)物,在體外對(duì)PHGDH表現(xiàn)出有效的酶抑制活性。利用微量熱泳動(dòng)（MST）測(cè)定和細(xì)胞熱轉(zhuǎn)變分析（CETSA）證實(shí),Azacoccone E直接與PHGDH結(jié)合。并且在細(xì)胞水平證明,該化合物對(duì)PHGDH依賴性癌細(xì)胞具有選擇性毒性,并能引起細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的酶活性動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),顯示Azacoccone E是底物3-磷酸甘油酸（3-PG）的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,并表現(xiàn)出時(shí)間依賴性抑制效果。此外,分子對(duì)接證明了Azacoccone E在PHGDH的變構(gòu)位點(diǎn)中具有低結(jié)合能。因此,Azacoccone... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選

圖 1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選（A）目的基因 PCR 擴(kuò)增，并跑瓊脂糖凝膠電泳；（B）利用瓊脂糖凝膠技術(shù)純化線載體質(zhì)粒，除去被限制性內(nèi)切酶切除的小分子量片段；（C）PCR 技術(shù)檢驗(yàn)重組質(zhì)電泳觀察目的條帶在 1000 bp 偏下位置。第一泳道位置均為 DNAmarker，2-4 泳道均為副孔。PHGDH 的小量誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)PHGDH-pET28a 重組質(zhì)粒導(dǎo)入 BL21 感受態(tài)，少量培養(yǎng)并檢測(cè)目的蛋白的表，SDS-PAGE 凝膠顯色結(jié)果顯示（圖 1.3），Ni-agrose 提取部分得到大量且的 34 KD 大小條帶，與目的蛋白分理論分子量大小一致。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文4.3 PHGDH 的大量表達(dá)與純化將少量檢測(cè)結(jié)果顯示 PHGDH 大量表達(dá)的甘油菌大量培養(yǎng)，先用 Ni-agrose對(duì)總蛋白進(jìn)行提取，用高濃度咪唑洗脫得到的目的蛋白，然后用凝膠排阻層析柱（Superdex200）進(jìn)一步分離純化，如圖 1.4A 所示，在 40mL 時(shí)有蛋白液開始流出，紫外吸收值開始上升，并在 59.1mL 位置達(dá)到最大，吸收值為 540mAU，且峰形對(duì)稱性好。進(jìn)一步用 SDS-PAGE 檢測(cè)，凝膠顯色結(jié)果顯示得到純度高且性質(zhì)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，蛋白位置大小與理論值一致（圖 1.4B）。


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