本文關(guān)鍵詞：氧氟沙星—繞丹寧衍生物誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自1962年喹諾酮類藥物誕生,氟喹諾酮類抗菌劑一直被臨床廣泛應(yīng)用。喹啉羧酸結(jié)構(gòu)是喹諾酮類藥物的骨架,通過抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性發(fā)揮作用,而真核細(xì)胞的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ與DNA旋轉(zhuǎn)酶具有高度的同源性,氟喹諾酮羧酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖也具有微弱的抑制作用。相關(guān)研究證明,氟喹諾酮碳-3羧基是將氟喹諾酮抗菌藥物改造成為抗腫瘤藥物的有效部位。本課題組通過氟喹諾酮化合物碳-3位與不同的活性藥效團(tuán)的拼合,已獲得若干活性較強(qiáng)的抗腫瘤化合物,如肉桂醛氧氟沙星酰腙、對(duì)甲氧基肉桂醛左氧氟沙星酰腙,苯甲醛左氧氟沙星席夫堿等,能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖,通過線粒體或(和)受體凋亡通路誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡,其24 h的IC50值均低于10μmol/L。應(yīng)用pBR322質(zhì)粒DNA電泳實(shí)驗(yàn)已證明肉桂醛氧氟沙星酰腙衍生化合物為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II毒劑,能夠造成DNA損傷。但合成的多種化合物均因分子質(zhì)量大,溶解度低,影響細(xì)胞攝入等原因影響進(jìn)一步的應(yīng)用開發(fā),需進(jìn)一步改進(jìn)。繞丹寧屬五元雜環(huán)酮,結(jié)構(gòu)與類黃酮相似,在繞丹寧取代基上引入側(cè)鏈,增加溶解度,常被用于新藥合成。將氟喹諾酮骨架經(jīng)繞丹寧骨架修飾的設(shè)計(jì),國(guó)內(nèi)外目前尚未見報(bào)道。本課題組設(shè)計(jì)合成了一系列溶解性好,分子質(zhì)量較小的氟喹諾酮-繞丹寧結(jié)合的新型化合物,期望得到抗腫瘤活性顯著的臨床候選化合物。目的 通過對(duì)數(shù)十種新合成的氟喹諾酮衍生物的篩選,尋找并選擇對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有明顯生長(zhǎng)抑制作用的化合物,初步探索其誘導(dǎo)凋亡作用,為此類化合物的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論基礎(chǔ)。方法 MTT法檢測(cè)氟喹諾酮衍生物及其他藥物對(duì)細(xì)胞的增殖影響;DAPI熒光染色法檢測(cè)所選化合物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞造成的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化;TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期變化;Western Blot法測(cè)定凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白p53、Caspase-3表達(dá)量的變化。結(jié)果 前期經(jīng)大量篩選,尋找出12抗腫瘤活性較明顯的饒丹寧-氟喹諾酮類衍生物,其中R1,R3,R4和R5對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用均較顯著,其中6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1,8-(2-甲基亞乙氧基)-1,4-二氫-4-氧代-3-(3-芐基-2-硫氧代噻唑啉-4-酮-5-叉甲基)喹啉(氧氟沙星-繞丹寧衍生物),R3,對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用效果最為顯著,在2~20mmol/L的濃度范圍內(nèi)能明顯抑制SMMC-7721細(xì)胞、CaCO-2細(xì)胞和EC-9706細(xì)胞的增殖;對(duì)SMMC-7721細(xì)胞24h IC_(50)值達(dá)到3.893mmol/L(r~2=0.8304),48 h為3.849mmol/L(r~2=0.7706),72 h為2.892mmol/L(r~2=0.7558),對(duì)EC-9706細(xì)胞和CaCO-2細(xì)胞的24h IC_(50)值分別是4.181mmol/L(r~2=0.8833)、3.408mmol/L(r~2=0.9601);作為對(duì)照,舒尼替尼作用于SMMC-7721細(xì)胞24h的IC50值為8.075mmol/L(r~2=0.9845);氧氟沙星鹽酸鹽作用于SMMC-7721細(xì)胞24h的IC50值為240.137mmol/L(r~2=0.8005);R3作用于L-02細(xì)胞24 h的IC50值為33.959mmol/L(r~2=0.9309)。DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變的結(jié)果顯示,R3處理后,SMMC-7721細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞核固縮、碎裂,染色質(zhì)凝集、邊緣化和凋亡小體出現(xiàn)等特征性凋亡形態(tài)學(xué)改變。TUNEL法結(jié)果顯示,濃度分別為2.688mmol/L,3.893mmol/L和5.639mmol/L的R3處理組的細(xì)胞凋亡率分別是(34.44±4.53)%,(48.40±7.52)%和(62.27±6.86)%,與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率顯著升高。細(xì)胞的周期檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組及濃度分別為2.688mmol/L,3.893mmol/L和5.639mmol/L的R3處理組的G_0/G_1期細(xì)胞比值分別為(36.08±1.82)%,(54.24±9.08)%,(62.84±4.74)%和(69.78±4.60)%,S期細(xì)胞比值分別為(28.50±3.33)%,(17.31±6.66)%,(30.65±4.71)%和(24.79±4.03)%,G_2/M期細(xì)胞比值分別為(35.41±3.62)%,(28.45±3.30)%,(6.53±0.54)%和(5.34±1.01)%,Sub-G_1期細(xì)胞比值分別為(2.44±0.44)%,(11.31±4.08)%,(18.90±2.37)%和(31.15±4.86)%,G_0/G_1期,G_2/M期和Sub-G_1期變化與對(duì)照組相比具有顯著差異,S期細(xì)胞變化與對(duì)照組無顯著差異,表明R3處理SMMC-7721細(xì)胞后,細(xì)胞周期被阻滯,增殖阻斷點(diǎn)在G_1-S期檢測(cè)點(diǎn)。Western Blot結(jié)果顯示,R3處理后,P53蛋白表達(dá)量、Caspase-3蛋白表達(dá)量及其活性裂解小片段增加。結(jié)論 (1)氟喹諾酮衍生物R3主要通過阻斷G_1-S期檢測(cè)點(diǎn)顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,并且對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的選擇抑制作用。(2)R3能夠顯著誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：氧氟沙星-繞丹寧衍生物 肝癌 細(xì)胞凋亡 p53
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 前言11-13
• 1 材料、試劑與儀器13-19
• 1.1 細(xì)胞培養(yǎng)13
• 1.2 主要材料、試劑13-15
• 1.3 主要試劑配制15-16
• 1.4 主要儀器16-19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 2.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖改變19-20
• 2.1.1 細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線19
• 2.1.2 細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)19-20
• 2.2 DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變20
• 2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率20
• 2.4 PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化20
• 2.5 Western Blot檢測(cè)p53和Caspase-3 蛋白表達(dá)變化20-22
• 2.5.1 提取細(xì)胞總蛋白20-21
• 2.5.2 BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白量21
• 2.5.3 蛋白凝膠電泳21-22
• 2.5.4 蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印22
• 2.5.5 化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法顯色22
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析22-23
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-33
• 3.1 12種氟喹諾酮類-饒丹寧衍生物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用23
• 3.2 R3對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用23-26
• 3.3 R3對(duì)EC-9706細(xì)胞的增殖抑制作用26
• 3.4 R3對(duì)CaCO-2 細(xì)胞的增殖抑制作用26-27
• 3.5 R3對(duì)L-02細(xì)胞的增殖抑制作用27
• 3.6 氧氟沙星對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用27
• 3.7 舒尼替尼對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用27-28
• 3.8 R3、舒尼替尼及氧氟沙星對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用比較28
• 3.9 R3對(duì)SMMC-7721細(xì)胞與L-02細(xì)胞的增殖抑制作用比較28-29
• 3.10 DAPI染色法觀察細(xì)胞凋亡后細(xì)胞核形態(tài)學(xué)方面的變化情況29
• 3.11 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞的凋亡率改變29-30
• 3.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)R3誘導(dǎo)凋亡作用后的周期變化30-31
• 3.13 R3對(duì)細(xì)胞p53蛋白的影響31
• 3.14 R3對(duì)細(xì)胞Caspase-3 蛋白的影響31-33
• 4 討論33-35
• 5 結(jié)論35-37
• 參考文獻(xiàn)37-42
• 文獻(xiàn)綜述42-56
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 附錄A 英文縮略詞對(duì)照表56-58
• 附錄B 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文情況58-60
• 致謝60-62

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