目的:端粒對基因組的穩(wěn)定性起著重要作用,端粒功能異常與疾病的發(fā)生息息相關(guān)。包括G四鏈體在內(nèi)的高級結(jié)構(gòu),會引起端粒功能障礙,阻礙端粒酶識別并抑制端粒延長,導(dǎo)致端�？s短。研究表明,一些小分子配體可以結(jié)合并穩(wěn)定該結(jié)構(gòu),引起端粒DNA損傷并抑制端粒酶活性,進而抑制癌癥的發(fā)生。然而,我們發(fā)現(xiàn)端粒酶可以修復(fù)這些端粒異常。在這里,我們試圖回答G4穩(wěn)定性配體和端粒酶抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用是否可以誘導(dǎo)長期DNA損傷并抑制腫瘤生長。方法:（1）在天然化合物數(shù)據(jù)庫中進行基于分子對接的虛擬篩選分析,以鑒定新型G4穩(wěn)定性配體。通過圓二色光譜和紫外可見光譜的熱變性實驗進一步證明該配體（大黃素）對G4具有穩(wěn)定作用。此外,采用IF-FISH的方法進一步證明大黃素對細胞內(nèi)端粒G4的影響。（2）大黃素處理不同種類的細胞不同時間,采用IF-FISH和中期染色體FISH實驗,檢測大黃素對基因組DNA損傷和端粒功能的影響;采用TUNEL和SA-β-gal的方法檢測大黃素對細胞凋亡和衰老的影響。（3）大黃素處理不同種類的細胞不同時間,采用TRAP和q-RT-PCR的方法檢測大黃素對端粒酶活性的影響。（4）通過端粒酶抑制劑抑制端粒酶活性... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

G4穩(wěn)定性配體的虛擬篩選A.大黃素與雜交型G4結(jié)構(gòu)的分子對接復(fù)合物；B.大黃素與反平行G4結(jié)構(gòu)的分子對接復(fù)合物；C.圓二色光譜的熱變性實驗，解鏈溫度（Tm）值反映了有無大黃素處理后G4的穩(wěn)定性；D.紫外可見光譜的熱變性實驗，解鏈溫度（Tm）值反映了有無大黃素

圖 1.2 大黃素對細胞內(nèi)端粒 G4 的影響A. 大黃素處理細胞 48 小時對端粒 G4 的影響，白色箭頭代表端粒和 G4 的共定位。B. 大黃素處理后端粒 G4 的百分比，比例尺是 2 μm。*P<0.05，**P<0.01。1.3 討論本實驗通過對潛在的G4穩(wěn)定性配體進行基于分子對接的虛擬篩選（SBVS），根據(jù)能量分析我們得到了六個化合物作為反平行和雜交型G4結(jié)構(gòu)的配體。其中，大黃素是與這兩種結(jié)構(gòu)親和力最強的化合物。分子對接可以通過優(yōu)化打分函數(shù)和搜索算法實現(xiàn)最優(yōu)化。各種各樣的打分函數(shù)均有不足，故可以采用一致性打分：對多種打分函數(shù)進行整合進而對系統(tǒng)進行綜合性評價。分子對接軟件常見的有：AutoDock Vina[48]和 DOCK[49]等。就對接能力而言，AutoDock Vina 是較好的分子對接軟件之一，AutoDock Vina 打分函數(shù)包括的主要內(nèi)容有：空間相互作用項，氫鍵作用項和疏水相互作用項[50]。基于受體的虛擬篩選是基于受體的三維構(gòu)象，借助分子對接將數(shù)據(jù)庫內(nèi)小分子配體與受體結(jié)合，再利用打分函數(shù)分析小分子配體與受體的親和性，最后對所得結(jié)果排名篩選出潛在的小分子配體[51]。本實驗就是利用 G4 三維構(gòu)象為受體進行虛擬篩選。

22圖 2.1 大黃素對 HeLa 細胞基因組 DNA 的短期影響A. 大黃素對細胞生長的影響；B. 大黃素對細胞形態(tài)的影響，比例尺是 50 μm；C. 大黃素對基因組 DNA 損傷的影響，免疫熒光檢測 DNA 損傷標志蛋白 γ-H2AX，比例尺是 10 μm；D. DNA 損傷統(tǒng)計結(jié)果；E. 大黃素對凋亡的影響，比例尺是 20 μm；F.凋亡統(tǒng)計結(jié)果；G. 大黃素對衰老的影響；H. 衰老統(tǒng)計結(jié)果，比例尺是 20 μm。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。


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