目的:分離純化高親和力的人硫氧還蛋白還原酶（TrxR）蛋白,完成初步的活性鑒定。方法:優(yōu)化重組人TrxR蛋白的原核表達條件,再通過親和層析法分離純化得到高純度的TrxR重組蛋白。采用5,5′-二硫雙（2-硝基苯甲酸）（DNTB）法比較重組人TrxR蛋白、商業(yè)化鼠肝提取TrxR蛋白以及重組人TrxR-ΔC蛋白的酶活力,并用TrxR特異性抑制劑金諾芬（Auranofin）分別檢測其對三種蛋白的抑制效率。結(jié)果:優(yōu)化了重組人TrxR蛋白的原核表達條件,得到高純度目的蛋白。在8個測量時間點（120～330 s）,TrxR的吸光度>pET-TRS_TER>TrxR-ΔC（P<0.05）。TrxR和pET-TRS_TER的抑制率隨抑制劑濃度的減小而減小;TrxR-ΔC蛋白在抑制劑濃度0.000 004 77μmol/mL的活性低于其他10個濃度（0.019 50～5.000 00μmol/mL）（P<0.05）;抑制劑在0.000 019 1μmol/mL濃度時蛋白活性低于抑制劑濃度為5.000 00μmol/mL（P<0.05）... 

【文章來源】：皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2020年05期

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圖1 兩種誘導(dǎo)溫度下的TrxR重組蛋白誘導(dǎo)時間優(yōu)化

破碎誘導(dǎo)不同時間后的菌體,通過SDS-PAGE凝膠電泳,觀察上清液與沉淀中的目的蛋白的含量,比較不同誘導(dǎo)時間后的上清溶液中TrxR蛋白的含量差異。結(jié)果顯示:3個時間點的目的蛋白大部分存在于上清液中,且上清液中的目的蛋白表達量基本相同(圖2)。2.3 TrxR蛋白的純化與鑒定

結(jié)果顯示,當(dāng)測量時間為30 s時,3種蛋白之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)測量時間為60 s和90 s時,TrxR和pET-TRSTER之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但均高于 TrxR-ΔC的吸光度(P<0.05)。其他8個測量時間點, TrxR的吸光度>pET-TRSTER>TrxR-ΔC(P<0.05)。見表1。2.5 金諾芬對3種蛋白的活性抑制效果


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