藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)是一種常見藥物不良反應(yīng),是導(dǎo)致藥物研發(fā)失敗和從市場撤回的主要原因。根據(jù)研究表明傳統(tǒng)的藥物肝毒性評價(jià)主要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn),但由于大量使用動(dòng)物、耗費(fèi)時(shí)間長、費(fèi)用高、靈敏度低及物種差異性等導(dǎo)致現(xiàn)有的動(dòng)物模型并不能很好的評價(jià)人體的肝損傷。而隨著現(xiàn)代對藥物肝毒性作用機(jī)制的深入了解,基于“毒性通路”與“毒性作用機(jī)制”的毒理學(xué)替代法應(yīng)運(yùn)而生,用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)代替動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已成為藥物肝毒性預(yù)測的重要方向。在2007年美國國家研究理事會(NRC,The US National Research Council)正式發(fā)布的“21世紀(jì)的毒性試驗(yàn):遠(yuǎn)景與策略”報(bào)告中提出:基于“毒性通路”的藥物毒性預(yù)測是外源化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)將引發(fā)分子起始事件(molecular initiate event,MIE),擾動(dòng)毒性通路,導(dǎo)致一系列生物組織(包括細(xì)胞、亞細(xì)胞、組織器官等)產(chǎn)生不良反應(yīng)結(jié)果。通過體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn),將藥物擾動(dòng)毒性通路的劑量和毒性效應(yīng)關(guān)聯(lián)起來,可實(shí)現(xiàn)對藥物安全性較為全面的評估。而高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析技術(shù)在替代毒理學(xué)中的應(yīng)用正好為這一思路提供了極大的輔助作用。HCS是利用熒光顯微鏡成像自動(dòng)化,對細(xì)胞形態(tài)及其中熒光靶點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與分布,進(jìn)行自動(dòng)化的定量和定位分析,獲得的藥物毒性檢測數(shù)據(jù),可做出藥物毒性的劑量-效應(yīng)曲線,分析出藥物引起的早期細(xì)胞毒性的劑量,從而實(shí)現(xiàn)對藥物潛在毒性更為精確的預(yù)測。本研究是以HepG2細(xì)胞為模型,根據(jù)藥物作用機(jī)制從多種藥物中篩選6種代表性的藥物:紫杉醇、鬼臼毒素、順鉑、5-氟尿嘧啶及常用于肝損傷模型建立的CCl_4飽和溶液和藥物的分散乳化劑的表面活性劑SDS為研究對象,用MTT測其IC_(50)值,并以IC_(50)值為參考(CCl_4其100%飽和溶液為參考),取其100%、75%、50%、25%、10%的5個(gè)濃度梯度作用細(xì)胞1h、2h、4h、24h,然后采用HCS結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)檢測藥物直接作用細(xì)胞引起的相關(guān)指標(biāo)的變化(如:細(xì)胞數(shù)量、DNA含量、鈣穩(wěn)態(tài)、ROS、線粒體膜電位、細(xì)胞膜通透性等),并綜合分析各個(gè)指標(biāo)建立分析方法,結(jié)果表明紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶、SDS對HepG2細(xì)胞的的肝細(xì)胞毒性為細(xì)胞膜的完整性受損導(dǎo)致的;鬼臼毒素則是由于鈣離子濃度升高導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起的;CCl_4細(xì)胞毒性則是由ROS引起,并建立HCS檢測早期藥物肝毒性的方法。本研究根據(jù)紫杉醇和鬼臼毒素抗腫瘤的作用機(jī)制,從與其機(jī)制相同的多種藥物篩選出兩種藥物分別為秋水仙堿和依托泊苷,采用同樣HCS方法檢測藥物直接作用細(xì)胞引起的相關(guān)指標(biāo)的變化,并對已建立的HCS分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示秋水仙堿表現(xiàn)出與紫杉醇相同毒性作用,依托泊苷同樣也表現(xiàn)出相同的毒性作用,表明HCS檢測藥物早期肝毒性的方法可行性。本研究利用已經(jīng)建立的HCS檢測早期肝毒性的方法對中藥的早期肝毒性進(jìn)行研究,從具有肝毒性中藥中選出兩種不同成分中藥單體分別為薯蕷皂苷和澤瀉醇B,通過HCS檢測其早期肝毒性結(jié)果顯示澤瀉醇B和薯蕷皂苷對HepG2細(xì)胞毒性為氧化應(yīng)激導(dǎo)致的,并推測氧化應(yīng)激與鐵凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究是以炮制后熟三七中的人參總皂苷和人參皂苷單體為研究對象,測其細(xì)胞毒性,研究炮制時(shí)間對細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果顯示:炮制后人參總皂苷的顏色和組成成分發(fā)生變化,炮制時(shí)間與組成成分含量及細(xì)胞毒性成正相關(guān)(P0.001);表明生三七不能過度炮制,炮制時(shí)間超過9h后表現(xiàn)一定毒副作用,人參總皂苷和人參皂苷單體表現(xiàn)出一定細(xì)胞毒性,并具有潛在的肝毒性。綜上所述,利用HCS檢測方法可以多參數(shù)、多指標(biāo)、快速、高通量的檢測藥物早期肝毒性,比現(xiàn)有方法的靈敏度和特異性高,增加了安全性,降低了實(shí)驗(yàn)成本,并且填補(bǔ)HCS在檢測天然化合物方面的空白,擴(kuò)大HCS應(yīng)用領(lǐng)域。
【學(xué)位單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

圖 2.1 5 種熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光圖片F(xiàn)igure 2.1 Fluorescent images corresponding to five fluorescent probes表 2.1：檢測藥物肝毒性所使用的熒光探針表 2.1 Fluorescent probes for detecting liver toxicity of drugsFluorescentprobeDetectionindexWavelengthChannel（nm）Color Finalconcentration(μM)TimeHoechst33342 Cell numberDNA IntensityNuclear area361/486 Blue 4Fluo.4 Ca45min2+Cell area494/516 Green 2TMRM MMP 549/576 Orane 1

2.5.2.1 紫杉醇早期肝毒性分析結(jié)果如圖2.2-A所示，不同濃度紫杉醇作用HepG2細(xì)胞后，在濃度2.5nM、6.25nM（10%IC50、25%IC50）時(shí)，作用細(xì)胞 1h、2h、4h、24h 后細(xì)胞的 6 個(gè)毒性指標(biāo)沒有發(fā)生顯著變化；在 12.5nM (50%IC50) 濃度時(shí)，4h 表現(xiàn)為細(xì)胞膜通透性開始發(fā)生改變，24h 時(shí)回復(fù)正常水平，隨后線粒體膜電位 24h 時(shí)表現(xiàn)為降低，其他毒性指標(biāo)隨時(shí)間增加沒有顯著變化；在 18.75nM (75%IC50)濃度時(shí)

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文根據(jù)鬼臼毒素抗腫瘤的作用機(jī)制，其作為 DNA 拓?fù)涿敢种苿┮种?DNA 解旋，引起 DNA 含量的減少，從而引起細(xì)胞的凋亡，HCS 檢測的 DNA 含量的變化（實(shí)驗(yàn)中 DNA 含量增加原因可能是藥物導(dǎo)致細(xì)胞核皺縮引起 DNA 聚集，使得熒光強(qiáng)度增加，從而）驗(yàn)證了這一結(jié)論。而鬼臼毒素對 HepG2 細(xì)胞毒性作用可能是由細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，使鈣穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致的。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2884482