細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度保守的對(duì)正常發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的過(guò)程。成人體內(nèi)每天大約有五千萬(wàn)到七千萬(wàn)細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡,無(wú)限制的細(xì)胞凋亡具有嚴(yán)重的病理后果,因此體內(nèi)細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格管控。癌癥是一種細(xì)胞因損傷或惡變而獲得無(wú)限增殖能力的疾病,而逃避細(xì)胞凋亡是癌細(xì)胞的重要特征之一。在過(guò)去三十年中,研究已闡明癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡抑制的機(jī)制,這為研究靶向細(xì)胞凋亡的療法奠定了基礎(chǔ)。目前研究較成熟的細(xì)胞凋亡通路有兩條:死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路。其中,Bcl-2家族蛋白作為關(guān)鍵地細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子之一,在線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞通過(guò)過(guò)表達(dá)抗凋亡Bcl-2蛋白或低表達(dá)促凋亡Bcl-2蛋白來(lái)逃避細(xì)胞凋亡,因此,通過(guò)靶向抗凋亡Bcl-2蛋白(如抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑)或重新激活促凋亡Bcl-2蛋白(如組蛋白去乙�；敢种苿�)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。新型抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑研究目前已報(bào)道的抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑大多為BH3模擬物,即通過(guò)模擬BH3-only蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域與抗凋亡Bcl-2蛋白的疏水性結(jié)合腔間特異性結(jié)合,干擾抗凋亡和促凋亡Bcl-2蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用。酪氨酸衍生物41是本課題組過(guò)去研究制備的一個(gè)化學(xué)合成中間體,近期發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)Bcl-2蛋白具有一定的親和力(Ki=8.4 μM),適合作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行深入結(jié)構(gòu)改造。分子對(duì)接結(jié)果顯示,41占據(jù)Bcl-2蛋白BH3疏水結(jié)合腔的p3和p4 口袋,而結(jié)構(gòu)中苯磺酰胺部分的苯環(huán)朝向p2 口袋,但并未與之結(jié)合。結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道的Bcl-2蛋白抑制劑的構(gòu)效關(guān)系,我們保留了先導(dǎo)化合物41的酪氨酸骨架和苯磺酰胺部分,在苯磺酰胺部分的苯環(huán)上引入取代基(硝基和R2),以期增加化合物與p2 口袋的結(jié)合,提高化合物與Bcl-2蛋白的親和力。其次,我們根據(jù)藥物化學(xué)的生物電子等排原理和同系原理將先導(dǎo)化合物41結(jié)構(gòu)中的聯(lián)苯基團(tuán)替換為取代苯基(R1)、Boc替換為各種�；�(R3),考察這兩部分對(duì)化合物與Bcl-2蛋白的親和力的影響。通過(guò)上述對(duì)先導(dǎo)化合物41的結(jié)構(gòu)改造我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一系列酪氨酸衍生物(series A)。此外,我們應(yīng)用構(gòu)象限制性原理,將酪氨酸骨架進(jìn)行芳香氨基酸側(cè)鏈環(huán)化,以實(shí)現(xiàn)對(duì)先導(dǎo)化合物的骨架躍遷,設(shè)計(jì)合成了一系列四氫異喹啉類(lèi)衍生物(series B)。與series A設(shè)計(jì)思路類(lèi)似,我們?cè)诒交酋０凡糠值谋江h(huán)上引入取代基(硝基、R3),以期增加化合物與p2 口袋的結(jié)合,增強(qiáng)化合物與Bcl-2蛋白的親和力;根據(jù)藥物化學(xué)生物電子等排原理和同系原理將先導(dǎo)化合物41結(jié)構(gòu)中的聯(lián)苯基團(tuán)替換為烷基和取代苯基(R1)、Boc替換為各種烷基(R2),考察這兩部分對(duì)化合物與Bcl-2蛋白的親和力的影響。對(duì)合成的seriesA和seriesB系列目標(biāo)化合物,我們首先采用熒光偏振法測(cè)定其對(duì)Bcl-2蛋白的親和力,然后選取代表化合物測(cè)定其對(duì)Bcl-XL和Mcl-1蛋白的親和力,探討目標(biāo)化合物對(duì)Bcl-2家族蛋白的選擇性;同時(shí)采用MTT法測(cè)定代表化合物抗細(xì)胞增殖能力;根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取化合物測(cè)定其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及caspase-3活化的能力。測(cè)試結(jié)果顯示,部分目標(biāo)化合物對(duì)Bcl-2蛋白的親和力明顯提升,14個(gè)series A化合物和14個(gè)series B化合物的活性?xún)?yōu)于先導(dǎo)化合物41,其中A3、A24、A28、B25和B26等目標(biāo)化合物的活性?xún)?yōu)于陽(yáng)性對(duì)照棉酚。對(duì)series A化合物而言,Boc基團(tuán)對(duì)目標(biāo)化合物與Bcl-2蛋白的親和力有很大影響。去除Boc基團(tuán)后,相應(yīng)目標(biāo)化合物與Bcl-2蛋白的親和力喪失,如A14-A19;而當(dāng)Boc被類(lèi)似的�；鎿Q后,相應(yīng)目標(biāo)化合物與Bcl-2蛋白的親和力保持或提高,如A20-A28�？傮w而言,苯磺酰胺苯環(huán)上取代基取代有利于相應(yīng)目標(biāo)化合物與Bcl-2蛋白的親和力,如A3、A24和A28等;但是對(duì)位環(huán)烷基氨基類(lèi)取代基除外,該類(lèi)取代基將導(dǎo)致相應(yīng)目標(biāo)化合物與Bcl-2蛋白的親和力喪失,如A8、A9和A27。相對(duì)而言,聯(lián)苯部分的變化對(duì)相應(yīng)目標(biāo)化合物與Bcl-2蛋白的親和力影響不大,如A1 vs A3 vs A5、A6 vs A7 和 A24 vs A28。對(duì)series B化合物而言,當(dāng)X為氫原子(B1-B5)或者R3為各種胺基(B10-B12,B18,B27-B29)時(shí),相應(yīng)目標(biāo)化合物對(duì)Bcl-2蛋白親和力基本喪失;R1為取代芐基的目標(biāo)化合物(如B9、B19和B25)對(duì)Bcl-2蛋白的親和力優(yōu)于R1為丙基的目標(biāo)化合物(B6和B7);R2的變化對(duì)相應(yīng)化合物對(duì)Bcl-2蛋白的親和力影響不大,但是4-苯基芐基除外,該取代基將導(dǎo)致相應(yīng)化合物對(duì)Bcl-2蛋白親和力基本喪失(如B13 和 B20)。研究發(fā)現(xiàn),代表化合物A1、A24、A28、B19、B21、B25和B26對(duì)Mcl-1蛋白也具有良好的親和力,其中A28、B25和B26對(duì)Mcl-1蛋白的親和力優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照棉酚;上述化合物與Bcl-XL蛋白親和力較差。代表化合物A1、A24、A28、B25和B26對(duì)腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的抗細(xì)胞增殖活性,而對(duì)正常細(xì)胞的抗增殖活性較差,表現(xiàn)出一定的腫瘤細(xì)胞選擇性;其中,A28的抗細(xì)胞增殖活性與陽(yáng)性對(duì)照棉酚相當(dāng)。進(jìn)一步的研究表明,代表化合物A28和B25可劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞細(xì)胞凋亡;10 μM和20 μ濃度的A28誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞48 h分別可導(dǎo)致6.2%和22.2%的細(xì)胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO對(duì)照組的凋亡率只有2.6%;15 μM和30 μM濃度的B25誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞48 h分別可導(dǎo)致7.3%和21.3%的細(xì)胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO對(duì)照組的凋亡率只有3.2%。此外,A28和B25還可劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞中caspase-3的活化。新型組蛋白去乙酰化酶抑制劑研究前期我們?cè)谠薪Y(jié)構(gòu)類(lèi)型基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)合成了一系列2,6-二取代嘌呤類(lèi)組蛋白去乙�；敢种苿�,初步活性研究發(fā)現(xiàn),部分化合物具有與陽(yáng)性對(duì)照SAHA相當(dāng)甚至更好的體外組蛋白去乙�；敢种苹钚�,遺憾的是這些化合物的體外抗腫瘤增殖活性一般;活性最優(yōu)化合物H5r對(duì)HeLa細(xì)胞提取物(主要含HDAC1和HDAC2)的IC50值為0.075 μM。我們以化合物H5r為先導(dǎo)化合物,運(yùn)用生物電子等排原理將酶表面識(shí)別區(qū)的2,6-二取代嘌呤母核以2,9-二取代嘌呤替換,在嘌呤2位引入氯、氨基、取代胺基、嗎啉和磺酰胺基,9位引入各種烷基,考察相應(yīng)2,9-二取代嘌呤作為酶表面識(shí)別區(qū)對(duì)化合物活性的影響;同時(shí)運(yùn)用同系原理改變連接臂的長(zhǎng)度,將連接基團(tuán)的-CH2CONH-簡(jiǎn)化為-NH-,考察連接臂的長(zhǎng)度對(duì)化合物活性的影響。通過(guò)上述結(jié)構(gòu)改造我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一系列新型組蛋白去乙酰化酶抑制劑(series C)。對(duì)合成的series C化合物,我們首先測(cè)試了其體外抑酶活性,并且選取活性較好的化合物進(jìn)一步測(cè)定了其對(duì)HDAC2和HDAC8亞型的抑制活性;其次,采用MTT法測(cè)定代表化合物抗腫瘤細(xì)胞增殖的能力;根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取代表化合物進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)組蛋白H3乙�；降挠绊�;此外,我們還測(cè)定了代表化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及caspase-3活化的能力。測(cè)試結(jié)果表明,9個(gè)目標(biāo)化合物表現(xiàn)出與陽(yáng)性對(duì)照SAHA相似或更優(yōu)的抑酶活性,其中目標(biāo)化合物C9、C13和C14活性最佳,IC50值分別為30 nM、26 nM和27nM。連接臂的長(zhǎng)度和嘌呤環(huán)的取代基對(duì)相應(yīng)化合物的抑酶活性均有影響。連接臂較短的化合物(C1-C5和C21)抑酶活性較差,而連接臂為5或6個(gè)亞甲基時(shí),相應(yīng)化合物的抑酶活性較好(C6-C20、C22-C25);當(dāng)嘌呤環(huán)2位為氨基或氯時(shí),相應(yīng)化合物的抑酶活性要優(yōu)于其它化合物,例如C13 vs C19和C12 vs C24,而且嘌呤環(huán)2位取代基越大時(shí),相應(yīng)化合物的抑酶活性越差;當(dāng)嘌呤環(huán)9位有取代時(shí),相應(yīng)化合物的抑酶活性要優(yōu)于此處無(wú)取代的化合物,例如C7 vs C6和C9 vs C8。此外,代表化合物C9、C13和C14對(duì)HDAC2的抑制活性?xún)?yōu)于HDAC8。代表化合物C9、C13和C14對(duì)腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的抗細(xì)胞增殖活性,其中化合物C13對(duì)所測(cè)三株腫瘤細(xì)胞的抗細(xì)胞增殖活性均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照SAHA。此外,western blot實(shí)驗(yàn)表明目標(biāo)化合物C13可劑量依賴(lài)性升高KG1細(xì)胞中組蛋白H3乙�；�,驗(yàn)證了該化合物的HDAC靶向性。此外,研究表明C13可劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)KG1細(xì)胞細(xì)胞凋亡:1μM和2 μM濃度的C13誘導(dǎo)KG1細(xì)胞24 h分別可導(dǎo)致20.7%和50.2%的細(xì)胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO對(duì)照組的凋亡率為14.2%;C13還可劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)KG1細(xì)胞中caspase-3的活化。綜上所述,研究新型的藥物啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡是近年抗癌藥物領(lǐng)域的新興研究方向。圍繞腫瘤細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制,我們?cè)O(shè)計(jì)合成了兩個(gè)系列抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑(series A和B)和一個(gè)系列組蛋白去乙�；敢种苿�(series C),期間共合成個(gè)了 147新化合物,其中新中間體65個(gè),新結(jié)構(gòu)目標(biāo)化合物82個(gè)。相應(yīng)目標(biāo)化合物已經(jīng)1HNMR、13CNMR和HRMS結(jié)構(gòu)確證,并進(jìn)行了熔點(diǎn)和純度的測(cè)定。相關(guān)的生物活性研究表明,部分化合物能夠有效的通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺死腫瘤細(xì)胞,這為課題組今后開(kāi)發(fā)更高效的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的新型抗癌藥物奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R979.1
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略語(yǔ)說(shuō)明
第一章 前言
    1.1 細(xì)胞凋亡
    1.2 Bcl-2家族蛋白
    1.3 Bcl-2家族蛋白與癌癥
    1.4 本論文研究的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的策略
    1.5 總結(jié)
第二章 抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及活性研究
    第一節(jié) 抗凋亡Bcl-2蛋白抑制劑研究進(jìn)展
        1.1 小分子抑制劑
        1.2 合成的BH3 α-螺旋模擬物
        1.3 多肽抑制劑
    第二節(jié) 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)及合成
        2.1 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)
        2.2 Series A化合物的合成
        2.3 Series B化合物的合成
    第三節(jié) 目標(biāo)化合物的生物活性研究
        3.1 熒光偏振實(shí)驗(yàn)
        3.2 抗細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
        3.4 Caspase-3檢測(cè)
        3.5 結(jié)果及討論
第三章 組蛋白去乙�；敢种苿┑脑O(shè)計(jì)、合成及活性研究
    第一節(jié) 組蛋白去乙酰化酶
    第二節(jié) 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)及合成
        2.1 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)
        2.2 標(biāo)化合物的合成
    第三節(jié) 目標(biāo)化合物的生物活性研究
        3.1 體外抑酶實(shí)驗(yàn)
        3.2 HDAC2和HDAC8抑制實(shí)驗(yàn)
        3.3 抗細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        3.4 Western blot實(shí)驗(yàn)
        3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
        3.6 Caspase-3檢測(cè)
        3.7 結(jié)果及討論
第四章 總結(jié)及展望
    4.1 總結(jié)
    4.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
附錄
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表


本文編號(hào)：2866360