乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年上升,且呈現(xiàn)出年輕化趨勢,嚴重危害著女性的健康。目前,藥物療法(化療)仍是乳腺癌的主要治療方法,但化療藥物在治療時會降低患者的血小板含量。因此,尋找一種既抑制乳腺癌生長又不影響血小板水平的藥物至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管為其提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),通過抑制腫瘤的血管生成是治療腫瘤的有效策略。同時在腫瘤微環(huán)境中,大量存在的巨噬細胞能釋放多種促血管生成因子,進而促進腫瘤的血管生成,故可尋找通過巨噬細胞抑制血管生成的藥物。艾曲波帕(Eltrombopag,ELB)是一種促血小板生成素受體激動劑,用于慢性免疫性血小板減少癥的治療。研究證明ELB具有抑制腫瘤細胞增殖的作用,但其抑制腫瘤生長及潛在的作用機制尚不明確。故本課題探討ELB是否能夠通過抑制血管生成進而抑制腫瘤的生長,且能維持血小板的水平。具體研究內(nèi)容如下:1、ELB對乳腺癌細胞系4T1增殖及血管生成相關(guān)因子的抑制作用。首先通過MTT實驗檢測ELB對不同腫瘤細胞的抑制作用,發(fā)現(xiàn)ELB對4T1細胞的抑制作用最顯著。其次通過q-PCR方法檢測ELB對4T1細胞血管生成相關(guān)因子mRNA的表達,來進一步探討ELB是否抑制腫瘤細胞的血管生成,結(jié)果顯示:ELB能夠抑制4T1細胞血管生成相關(guān)因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表達,且在20μM時抑制作用最顯著。2、ELB通過巨噬細胞(Raw264.7)介導(dǎo)的體外抗血管生成作用研究。通過MTT實驗、q-PCR方法和ELISA檢測ELB對Raw264.7細胞增殖、血管生成相關(guān)因子mRNA的表達及VEGF蛋白釋放的影響。結(jié)果顯示:ELB抑制Raw264.7細胞的增殖呈劑量依賴性,抑制Raw264.7細胞血管生成相關(guān)因子(VEGF-A、bFGF、MMP-9)mRNA的表達和VEGF蛋白的釋放。為了進一步探討ELB通過巨噬細胞對下游血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)功能的影響,將ELB(10μM)作用于巨噬細胞24 h后制備巨噬細胞上清液,然后作用于HUVEC,通過MTT實驗、細胞劃痕實驗、成管實驗檢測其對HUVEC功能的影響,同時檢測ELB直接作用對HUVEC功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):ELB作用于巨噬細胞24 h后的上清顯著抑制HUVEC的增殖、遷移和小管形成,但ELB直接作用HUVEC不影響其增殖、遷移和小管形成。表明ELB可通過巨噬細胞介導(dǎo)抑制血管生成。3、ELB體內(nèi)抑制腫瘤生長。構(gòu)建4T1乳腺癌模型,將小鼠分為陰性對照組(生理鹽水)、ELB低劑量組(75 mg/kg)、ELB中劑量組(150 mg/kg)、ELB高劑量組(185 mg/kg)和陽性對照組(吉西他濱75 mg/kg),考察給藥后小鼠的腫瘤體積、瘤重、抑瘤率、體重和血小板的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同劑量的ELB均能抑制腫瘤的生長,且ELB高劑量組(185 mg/kg)對腫瘤的抑制作用比吉西他濱組(75 mg/kg)更顯著;ELB各劑量組均能將小鼠血小板維持在正常水平,而吉西他濱組(75 mg/kg)使血小板降低。說明ELB在體內(nèi)能抑制腫瘤生長,并且產(chǎn)生的毒副作用低于吉西他濱。4、ELB對小鼠體內(nèi)腫瘤血管生成相關(guān)因素的研究。通過免疫熒光染色觀察ELB對腫瘤的血管形成、VEGF蛋白的釋放、巨噬細胞的募集作用,q-PCR方法檢測腫瘤中VEGF-A mRNA的表達情況。結(jié)果顯示:ELB能夠顯著抑制腫瘤的血管生成,同時能抑制腫瘤中巨噬細胞的募集、抑制VEGF蛋白的釋放及降低VEGF-A mRNA的表達。表明ELB能夠通過抑制腫瘤中血管生成來抑制腫瘤生長。本研究結(jié)果表明:ELB在體內(nèi)外均能抑制乳腺癌的生長,且不影響血小板的水平,其作用機制可能是通過抑制血管生成相關(guān)因子的表達。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

第一部分：ELB 體外抗腫瘤活性的研究。首先通過 MTT 實驗檢測 ELB 對不同腫瘤細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn) ELB 對 4T1 乳腺癌細胞的抑制作用最顯著。進一步通過 q-PCR 方法檢測 ELB 對 4T1 乳腺癌細胞血管生成相關(guān)因子（VEGF-A、bFGF、MMP-9）mRNA 的表達。第二部分：ELB 體外介導(dǎo)巨噬細胞抗血管生成作用的研究。首先通過 MTT實驗、q-PCR 和 ELISA 檢測 ELB 對巨噬細胞增殖、血管生成相關(guān)因子（VEGF-A、bFGF、MMP-9）mRNA 的表達及 VEGF 蛋白的影響；再通過 MTT 實驗、細胞劃痕實驗、Matrigel 基質(zhì)膠細胞成管實驗，觀察 ELB 通過巨噬細胞對內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成的影響。第三部分：ELB 體內(nèi)抗腫瘤活性的研究。構(gòu)建 4T1 荷瘤小鼠模型，分組給予不同劑量的 ELB 后，考察不同組小鼠的腫瘤體積變化、瘤重、抑瘤率及小鼠體重變化，研究 ELB 對腫瘤的抑制作用。然后通過免疫熒光染色觀察 ELB 對腫瘤的血管形成、巨噬細胞募集作用、VEGF 蛋白的表達，q-PCR 方法檢測腫瘤中VEGF-A mRNA 水平，血常規(guī)測血小板的含量。本課題的研究思路如圖 1.1 所示。

圖 2.1 ELB 作用于不同腫瘤細胞 48h 后的細胞增殖。（A）LLC 細胞。（B）4T1 細胞。（C）SMMC-7721 細胞。（D）A549 細胞。（E）H1299 細胞。2.3.2 ELB 抑制 4T1 細胞血管生成相關(guān)因子 mRNA 的表達腫瘤的生長需要血管為其提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)[75]。為了探討 ELB 對 4T1 細胞內(nèi)血管生成因子 mRNA 表達的影響，將不同濃度的 ELB（5 μM、10 μM、20 μM）作用 4T1 細胞 3 h 后提取總 RNA，用 q-PCR 方法檢測 4T1 細胞內(nèi)血管生成相關(guān)因子（VEGF-A、bFGF、MMP-9）mRNA 的表達水平。實驗結(jié)果如圖 2.2 所示，與 Control 組相比，ELB 以劑量依賴性抑制細胞內(nèi) VEGF-AmRNA、bFGF mRNA的表達，各組與 Control 組相比均有顯著性差異，且在 20 μM 時抑制作用最顯著（圖 2.2 A 和圖 2.2 B）；ELB 也呈劑量依賴性抑制細胞內(nèi) MMP-9 mRNA 的表達，但只有在 20 μM 時有顯著性差異（圖 2.2 C）。以上結(jié)果表明 ELB 能抑制4T1 細胞內(nèi) VEGF-A、bFGF、MMP-9 mRNA 的表達。A BC

不同腫瘤細胞 48h 后的細胞增殖。（A）LLC MMC-7721 細胞。（D）A549 細胞。（E）H1 4T1 細胞血管生成相關(guān)因子 mRNA 的要血管為其提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)[75]。為了 mRNA 表達的影響，將不同濃度的 ELB（ 后提取總 RNA，用 q-PCR 方法檢測 4T1bFGF、MMP-9）mRNA 的表達水平。實，ELB 以劑量依賴性抑制細胞內(nèi) VEGF-Aontrol 組相比均有顯著性差異，且在 20 μ.2 B）；ELB 也呈劑量依賴性抑制細胞內(nèi)μM 時有顯著性差異（圖 2.2 C）。以上-A、bFGF、MMP-9 mRNA 的表達。BC
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本文編號：2865959