目的:蛋白質(zhì)的結構與動力學研究對于理解其功能及作用機制具有重要意義。目前已有的,蛋白質(zhì)結構解析的方法主要包含X-射線單晶衍射、核磁共振技術、冷凍電鏡以及電子順磁共振(EPR)等。電子順磁共振(EPR)波譜方法結合定點自旋標記方法已成為蛋白質(zhì)結構與動力學研究必不可少的研究手段,特別是在生理條件下蛋白質(zhì)的動力學動態(tài)結構研究方面具有獨特的應用前景。采用定點自旋標記方法將順磁性物質(zhì)標記在蛋白質(zhì)的兩個特定的氨基酸殘基(通常是半胱氨酸)上,通過脈沖EPR測定自旋標記物之間的偶極相互作用,然后得到氨基酸殘基間的距離及其變化信息,進而探知蛋白質(zhì)結構與動力學的變化。在目前可得的自旋標記物中,trityl自由基吸引了最廣泛的注意,歸咎于其優(yōu)越的EPR性質(zhì)、高度的穩(wěn)定性及生理條件下長的弛豫時間。但是,文獻已報道的trityl標記物仍存在脂溶性過高、連接鏈的剛性不足、標記效率低以及生成的雙硫鍵易受巰基干擾等不足。鑒于此,本論文對trityl自由基進行了衍生化,合成得到了一系列基于邁克爾受體的trityl自旋標記物,考察了它們對巰基的反應性、選擇性及其巰基連接體對不同氧化還原物質(zhì)的穩(wěn)定性,揭示了吸電子取代基對自旋標記物性能的影響。方法:(1)以1,2,4,5-四(叔丁基硫代)苯為起始原料,經(jīng)縮酮化、還原、氧化等5步反應得到了醛基取代的三苯甲醇化合物;隨后,三苯甲醇衍生物經(jīng)Wittig或Henry反應得到了一系列含有不同邁克爾受體的自旋標記物前體;最后,通過酸處理得到了trityl自旋標記物。(2)采用EPR技術對所得自旋標記物進行了結構表征,并通過EPR譜圖模擬得到了它們的超精細裂分常數(shù)。通過EPR以及紫外可見吸收光譜研究自旋標記物對巰基的反應性、選擇性及其穩(wěn)定性。結果:高效得到了4個含不同邁克受體的trityl自旋標記物,并采用HPLC方法分離得到了其中兩個標記物的Z和E構型。研究發(fā)現(xiàn),自旋標記物的Z和E構型呈現(xiàn)明顯不同的EPR超精細裂分常數(shù)。此外,邁克爾受體的吸電子性對標記物的反應性具有關鍵作用;僅有含強吸電子的硝基化合物NMA對巰基化合物(如谷胱甘肽、半胱氨酸)表現(xiàn)出了高度的反應性。紫外可見吸收光譜和EPR實驗結果表明NMA與巰基化合物的反應具有高度的選擇性,高標記效率(大于97%),得到的巰基加和物對生物氧化還原類物質(zhì)具有一定的穩(wěn)定性。值得一提的是,NMA與巰基反應前后的紫外可見吸收光譜和EPR波譜均呈現(xiàn)明顯差異;因此,可用采用紫外可見吸收光譜和EPR方法監(jiān)測自旋標記過程與標記效率。結論:本論文設計合成了具有不同邁克爾受體的trityl自旋標記物,并篩選得到了對巰基具有高度反應性和選擇性的自旋標記物NMA。NMA作為自旋標記物具有標記效率高、連接鏈短等優(yōu)點,克服了現(xiàn)有trityl自旋標記物的諸多不足,在EPR定點自旋標記領域?qū)⒂袕V泛的應用前景。本論文也為新型trityl自旋標記物的設計合成提供新思路,有望拓展EPR定點自旋標記方法在細胞內(nèi)的生物大分子結構與動力學研究方面的應用。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

詳細、精準的信息，成為了目前自旋標記領域的研含金屬蛋白含有天然的順磁中心外，一般蛋白質(zhì)不，因此自旋標記物是位點特異性自旋標記電子順磁目前常用的自旋標記物有：氮氧自由基、過渡態(tài)金ityl 自由基與上述自旋標記物相比具有以下優(yōu)勢：(1豫時間；(2)生物穩(wěn)定性高，不易受細胞內(nèi)的氧化還窄，信噪比高。基于上述優(yōu)勢，trityl 自由基可在細白質(zhì)距離測量。美國專利報道了穩(wěn)定的四硫取代的三苯甲基自由基基，如 CT-03 和 OX063（圖 1.1）在 EPR 研究領域l 自由基在 EPR 波譜中呈現(xiàn)出窄的單線峰（線寬為 ，使得 trityl 自由基對氧氣的敏感性很高：每 1 mM 的 mT[22]。正因為這些優(yōu)勢，trityl 自由基被廣泛應作

前不同的trityl自由基衍生物以及trityl自由基為基礎的衍生物具有自旋標記的應用潛質(zhì)。人首次使用 trityl 自由基（CT02-TP）作為自旋標記合成了一個對蛋白質(zhì)中巰基具有反應性的 trityl 自由 T4 溶菌酶突變蛋白的距離。該自旋標記物的合成由基 CT-03 與 L-半胱氨酸反應縮合反應，三氟乙酸2,2-二硫二吡啶反應形成以 trityl 自由基為基礎的自方法合成的 trityl 自旋標記物對巰基的反應性較低，(B)

3 甲磺酸酯官能團修飾的 trityl 自旋標記物的合成及與蛋白Joseph[26]報道了使用 trityl 自由基選擇性高活性的標質(zhì)以及蛋白質(zhì)與配體之間相互作用的優(yōu)勢。該課題桿菌的細胞外膜，他們使用具有甲磺酸酯官能團的，可以與蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基中的巰基反應記的蛋白質(zhì)。但是，trityl 自由基自旋標記物標記的R波譜測定蛋白質(zhì)距離時，其EPR波譜為寬峰。該實蛋白質(zhì)存在下形成了自聚集，大部分的自旋標記物合，因此，在以后蛋白質(zhì)距離測定中需要考慮自聚為，避免自聚集帶來的影響的方法之一就是采用親63 和 OX031 作為自旋標記物。Schiemann 課題組[40]首次使用 trityl 自由基衍生物在結構。該課題組合成了四種 trityl 自由基的衍生物（示），其中含有甲磺酸酯、烯烴以及炔基官能團，其 2016 年 Joseph 課題組報道的自旋標記物相比鏈長
【參考文獻】

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1 韓宇鵬;楊靜靜;汪薛良;王金晶;李崎;;采用圓二色譜和傅立葉變換紅外光譜法研究糖化與煮沸過程中蛋白質(zhì)Z的二級結構變化[J];中外酒業(yè)·啤酒科技;2015年11期

2 黃漢昌;姜招峰;朱宏吉;;紫外圓二色光譜預測蛋白質(zhì)結構的研究方法[J];化學通報;2007年07期

本文編號：2863130