發(fā)布時(shí)間：2020-10-30 23:14

　　 目的:蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)研究對(duì)于理解其功能及作用機(jī)制具有重要意義。目前已有的,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要包含X-射線單晶衍射、核磁共振技術(shù)、冷凍電鏡以及電子順磁共振(EPR)等。電子順磁共振(EPR)波譜方法結(jié)合定點(diǎn)自旋標(biāo)記方法已成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)研究必不可少的研究手段,特別是在生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)研究方面具有獨(dú)特的應(yīng)用前景。采用定點(diǎn)自旋標(biāo)記方法將順磁性物質(zhì)標(biāo)記在蛋白質(zhì)的兩個(gè)特定的氨基酸殘基(通常是半胱氨酸)上,通過(guò)脈沖EPR測(cè)定自旋標(biāo)記物之間的偶極相互作用,然后得到氨基酸殘基間的距離及其變化信息,進(jìn)而探知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)的變化。在目前可得的自旋標(biāo)記物中,trityl自由基吸引了最廣泛的注意,歸咎于其優(yōu)越的EPR性質(zhì)、高度的穩(wěn)定性及生理?xiàng)l件下長(zhǎng)的弛豫時(shí)間。但是,文獻(xiàn)已報(bào)道的trityl標(biāo)記物仍存在脂溶性過(guò)高、連接鏈的剛性不足、標(biāo)記效率低以及生成的雙硫鍵易受巰基干擾等不足。鑒于此,本論文對(duì)trityl自由基進(jìn)行了衍生化,合成得到了一系列基于邁克爾受體的trityl自旋標(biāo)記物,考察了它們對(duì)巰基的反應(yīng)性、選擇性及其巰基連接體對(duì)不同氧化還原物質(zhì)的穩(wěn)定性,揭示了吸電子取代基對(duì)自旋標(biāo)記物性能的影響。方法:(1)以1,2,4,5-四(叔丁基硫代)苯為起始原料,經(jīng)縮酮化、還原、氧化等5步反應(yīng)得到了醛基取代的三苯甲醇化合物;隨后,三苯甲醇衍生物經(jīng)Wittig或Henry反應(yīng)得到了一系列含有不同邁克爾受體的自旋標(biāo)記物前體;最后,通過(guò)酸處理得到了trityl自旋標(biāo)記物。(2)采用EPR技術(shù)對(duì)所得自旋標(biāo)記物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征,并通過(guò)EPR譜圖模擬得到了它們的超精細(xì)裂分常數(shù)。通過(guò)EPR以及紫外可見(jiàn)吸收光譜研究自旋標(biāo)記物對(duì)巰基的反應(yīng)性、選擇性及其穩(wěn)定性。結(jié)果:高效得到了4個(gè)含不同邁克受體的trityl自旋標(biāo)記物,并采用HPLC方法分離得到了其中兩個(gè)標(biāo)記物的Z和E構(gòu)型。研究發(fā)現(xiàn),自旋標(biāo)記物的Z和E構(gòu)型呈現(xiàn)明顯不同的EPR超精細(xì)裂分常數(shù)。此外,邁克爾受體的吸電子性對(duì)標(biāo)記物的反應(yīng)性具有關(guān)鍵作用;僅有含強(qiáng)吸電子的硝基化合物NMA對(duì)巰基化合物(如谷胱甘肽、半胱氨酸)表現(xiàn)出了高度的反應(yīng)性。紫外可見(jiàn)吸收光譜和EPR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NMA與巰基化合物的反應(yīng)具有高度的選擇性,高標(biāo)記效率(大于97%),得到的巰基加和物對(duì)生物氧化還原類物質(zhì)具有一定的穩(wěn)定性。值得一提的是,NMA與巰基反應(yīng)前后的紫外可見(jiàn)吸收光譜和EPR波譜均呈現(xiàn)明顯差異;因此,可用采用紫外可見(jiàn)吸收光譜和EPR方法監(jiān)測(cè)自旋標(biāo)記過(guò)程與標(biāo)記效率。結(jié)論:本論文設(shè)計(jì)合成了具有不同邁克爾受體的trityl自旋標(biāo)記物,并篩選得到了對(duì)巰基具有高度反應(yīng)性和選擇性的自旋標(biāo)記物NMA。NMA作為自旋標(biāo)記物具有標(biāo)記效率高、連接鏈短等優(yōu)點(diǎn),克服了現(xiàn)有trityl自旋標(biāo)記物的諸多不足,在EPR定點(diǎn)自旋標(biāo)記領(lǐng)域?qū)⒂袕V泛的應(yīng)用前景。本論文也為新型trityl自旋標(biāo)記物的設(shè)計(jì)合成提供新思路,有望拓展EPR定點(diǎn)自旋標(biāo)記方法在細(xì)胞內(nèi)的生物大分子結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)研究方面的應(yīng)用。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

詳細(xì)、精準(zhǔn)的信息，成為了目前自旋標(biāo)記領(lǐng)域的研含金屬蛋白含有天然的順磁中心外，一般蛋白質(zhì)不，因此自旋標(biāo)記物是位點(diǎn)特異性自旋標(biāo)記電子順磁目前常用的自旋標(biāo)記物有：氮氧自由基、過(guò)渡態(tài)金ityl 自由基與上述自旋標(biāo)記物相比具有以下優(yōu)勢(shì)：(1豫時(shí)間；(2)生物穩(wěn)定性高，不易受細(xì)胞內(nèi)的氧化還窄，信噪比高�；谏鲜鰞�(yōu)勢(shì)，trityl 自由基可在細(xì)白質(zhì)距離測(cè)量。美國(guó)專利報(bào)道了穩(wěn)定的四硫取代的三苯甲基自由基基，如 CT-03 和 OX063（圖 1.1）在 EPR 研究領(lǐng)域l 自由基在 EPR 波譜中呈現(xiàn)出窄的單線峰（線寬為 ，使得 trityl 自由基對(duì)氧氣的敏感性很高：每 1 mM 的 mT[22]。正因?yàn)檫@些優(yōu)勢(shì)，trityl 自由基被廣泛應(yīng)作

前不同的trityl自由基衍生物以及trityl自由基為基礎(chǔ)的衍生物具有自旋標(biāo)記的應(yīng)用潛質(zhì)。人首次使用 trityl 自由基（CT02-TP）作為自旋標(biāo)記合成了一個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)中巰基具有反應(yīng)性的 trityl 自由 T4 溶菌酶突變蛋白的距離。該自旋標(biāo)記物的合成由基 CT-03 與 L-半胱氨酸反應(yīng)縮合反應(yīng)，三氟乙酸2,2-二硫二吡啶反應(yīng)形成以 trityl 自由基為基礎(chǔ)的自方法合成的 trityl 自旋標(biāo)記物對(duì)巰基的反應(yīng)性較低，(B)

3 甲磺酸酯官能團(tuán)修飾的 trityl 自旋標(biāo)記物的合成及與蛋白Joseph[26]報(bào)道了使用 trityl 自由基選擇性高活性的標(biāo)質(zhì)以及蛋白質(zhì)與配體之間相互作用的優(yōu)勢(shì)。該課題桿菌的細(xì)胞外膜，他們使用具有甲磺酸酯官能團(tuán)的，可以與蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基中的巰基反應(yīng)記的蛋白質(zhì)。但是，trityl 自由基自旋標(biāo)記物標(biāo)記的R波譜測(cè)定蛋白質(zhì)距離時(shí)，其EPR波譜為寬峰。該實(shí)蛋白質(zhì)存在下形成了自聚集，大部分的自旋標(biāo)記物合，因此，在以后蛋白質(zhì)距離測(cè)定中需要考慮自聚為，避免自聚集帶來(lái)的影響的方法之一就是采用親63 和 OX031 作為自旋標(biāo)記物。Schiemann 課題組[40]首次使用 trityl 自由基衍生物在結(jié)構(gòu)。該課題組合成了四種 trityl 自由基的衍生物（示），其中含有甲磺酸酯、烯烴以及炔基官能團(tuán)，其 2016 年 Joseph 課題組報(bào)道的自旋標(biāo)記物相比鏈長(zhǎng)
【參考文獻(xiàn)】

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1 韓宇鵬;楊靜靜;汪薛良;王金晶;李崎;;采用圓二色譜和傅立葉變換紅外光譜法研究糖化與煮沸過(guò)程中蛋白質(zhì)Z的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化[J];中外酒業(yè)·啤酒科技;2015年11期

2 黃漢昌;姜招峰;朱宏吉;;紫外圓二色光譜預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究方法[J];化學(xué)通報(bào);2007年07期

本文編號(hào)：2863130