他汀類藥作為膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl-glytarylcoenzymeA,HMG-CoA)還原酶的抑制劑已廣泛用于心血管疾病的治療。流行病學資料表明他汀類藥物服用者的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患病率有所降低。有研究報道,辛伐他汀(Simvastatin,SV)能改善阿爾茨海默動物模型小鼠和老齡大鼠的認知功能,但是有關其分子機制迄今仍然不清楚。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)受體是離子型谷氨酸受體的一個亞型。NMDA受體受電壓門控和遞質門控的雙重門控通道影響。煙堿樣乙酰膽堿受體 α7亞型(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nACh受體)屬于配體門控型離子通道受體。海馬的突觸可塑性長時程增強(long-term potentiation,LTP)被認為是空間學習和記憶的一種細胞模式。LTP的誘導依賴于突觸后神經(jīng)元的NMDA受體Ca2+內(nèi)流。α7nACh受體作為Ca2+通道型受體,或通過誘導 PI3K-Akt(phosphatidylinosito 1-3 kinase-protein kinase B)和 ERK(extracellular-signal regulated kinase)信號通路,對于海馬突觸前神經(jīng)遞質釋放和LTP誘導起到重要的調控作用。抑制HMG-CoA還原酶能降低類異戊二烯化合物水平,如焦磷酸法呢酯(farnesyl-pyrophosphate,FPP)和焦磷酸香葉酯(geranylgeranyl-pyrophosphate,GGPP)。類異戊二烯化合物通過法尼基化小G蛋白調節(jié)Ras、Rho和Rab的活性。有研究報道敲除Ras基因能促進Src和NMDA受體亞基NR2B的磷酸化,增強NMDA受體活性。本課題提出SV可能通過降低類異戊二烯化合物來調控修飾NMDA受體和α7nACh受體的表達和活性,促進海馬突觸可塑性LTP的誘導,從而提高空間認知功能的科研設想。因此,我們首先研究SV對海馬突觸傳遞功能和可塑性的影響,再進一步研究SV對NMDA受體和α7nACh受體的修飾作用及其調控機制,以闡明SV促進海馬LTP誘導和增強空間認知功能的分子機制。研究目的1.明確SV對小鼠認知傳遞功能和海馬突觸可塑性的影響;2.闡明SV對NMDA受體的修飾作用及其分子機制;3.闡明SV對α7nACh受體的調控作用及其分子機制。材料與方法1.模型制備:(1)成年ICR雄鼠連續(xù)30天給予辛伐他汀20mg/kg/d灌胃(以下簡稱30d-SV小鼠)(第一部分實驗)；出生后25-30天的ICR乳鼠連續(xù)5天給予辛伐他汀20mg/kg/d腹腔注射(簡稱5d-SV小鼠)(第二部分實驗);(2)出生后25-30天的ICR乳鼠用SV(10μM)海馬腦片孵育4h(簡稱SV腦片)(第二和第三部分實驗);(3)法尼基轉化酶抑制劑FTI(50 mg/kg)腹腔注射(簡稱FTI小鼠);(4)法尼基轉化酶抑制劑FTI(1μmol/l)處理(簡稱FTI腦片)2.用Morris水迷宮的暗臺試驗和軌跡試驗,Y迷宮檢查小鼠的認知功能。3.用場電位方法檢測海馬Schaffer側支-CAl(ComuAmmonisl field)突觸傳遞(輸入-輸出曲線,I/O曲線,input-output relationship曲線),神經(jīng)遞質釋放(雙脈沖易化,paired-pulse facilitation,PPF),長時程增強(LTP)。4.用全細胞膜片鉗記錄檢測NMDA受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate 受體,AMPA 受體)和α7nACh受體電流。5.用Wester blot檢測海馬GluN2A、GluN2B蛋白水平,GluN2A、GluN2B、Src、PKC(protein kinas C)、PKA(protein kinas A)、CaMK II(calmodulin-kinase II)、Akt、Erk磷酸化水平。6.用 RT-PCR 檢測 GluN2A、GluN2B 表達。7.膜蛋白檢測實驗:用生物素化,提取膜蛋白,檢測α7nACh受體在膜表面的表達水平。8.免疫沉淀(IP):檢測α7nACh受體在蘇氨酸位點和絲氨酸位點的磷酸化水平。9.染色質免疫沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation,Chip):采用 Chip分析GluN2B基因啟動子區(qū)的乙酰化水平。結果結果一 SV通過減少焦磷酸法呢酯能促進海馬突觸傳遞和LTP,增強空間認知1.連續(xù)30天SV處理(30d-SV)引起成年小鼠在水迷宮暗臺實驗中的登臺潛伏期明顯減少,在軌跡實驗中站臺象限的游泳時間延長,以及在Y迷宮實驗中的進臂交替率增加,提示SV能增強小鼠的空間認知功能。2.30d-SV 小鼠海馬 Schaffer 側支-CA1 的 EPSP(excitatory post-synaptic potentiation)斜率比與對照小鼠增加,伴有PPF比率降低,提示SV能促進谷氨酸的釋放。3.與對照小鼠相比,30d-SV小鼠海馬NMDA受體依賴性LTP幅值增加——SV能增強LTP,NMDA受體非依賴性LTP誘導閾值降低——SV能易化LTP誘導。4.在30d-SV小鼠海馬的Akt及ERK2磷酸化水平增強。MLA能抑制30d-SV小鼠Akt和ERK2磷酸化水平增強。5.α7nACh受體阻斷劑MLA,MEK抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002能阻止30d-SV小鼠LTP誘導易化;MLA、U0126可阻止30d-SV小鼠LTP誘導增強,而此作用不受LY294002影響。6.用法尼醇(FOH)處理30d-SV小鼠,通過補充焦磷酸法呢酯(FPP)水平,能阻止SV增強空間認知和促進遞質釋放和LTP誘導。結果二SV通過降低FPP促進NMDA受體的表達和活性1.連續(xù)5天SV處理(5d-SV)小鼠或者海馬腦片進行SV孵育(SV腦片)都能增大NMDA受體電流(INMDA)的幅值,但是AMPA受體電流(IAMPA)幅值沒有明顯改變。用FOH可以阻斷SV對INMDA幅值的增強作用。用FTI連續(xù)5天處理小鼠(FTI小鼠)也顯示INMDA幅值增強。2.海馬GluN2A和GluN2B的磷酸化水平在5d-SV小鼠,SV腦片或FTI小鼠都明顯高于對照組水平。FOH可以阻斷SV對GluN2A/2B磷酸化的增強作用。3.與對照組相比,5d-SV 小鼠或者 FTI(Farnesyl Transferase Inhibitor)小鼠顯示GluN2B蛋白表達水平增強,但是SV腦片GluN2B蛋白表達不改變。FOH可以阻斷SV增強GluN2B蛋白表達。4.SV和FTI能增加Src的磷酸化。Src抑制劑PP2能阻斷SV和FTI對INMDA幅值及GluN2A/2B磷酸化的增強作用,但是不影響GluN2B表達的增加。5.5d-SV小鼠或者FTI小鼠顯示GluN2B的H3K9和H3K27組蛋白乙�；皆黾�。FOH可以抑制5d-SV小鼠的GluN2B組蛋白乙酰化水平增加。結果三SV通過降低FPP增強α7nACh受體活性和促進α7nACh受體上膜1.在SV腦片的海馬CA1錐體細胞,乙酰膽堿(ACh)誘導電流(IACh)的幅值明顯增加,但是配體的親和力及受體脫敏半衰期沒有明顯改變,提示SV增加α7nACh受體活性。2.與對照組相比,在SV腦片α7nACh受體膜蛋白水平明顯增加,而α7nACh受體磷酸化水平?jīng)]有改變,提示SV能促進α7nACh受體上膜。3.FOH可以阻斷SV增加IACh幅值和α7nACh受體上膜。FTI腦片顯示IACh幅值和α7nACh受體膜蛋白水平增加。4.與對照組相比,SV腦片的PKC和CaMKII磷酸化水平增加。FOH可以阻斷SV腦片的CaMKII磷酸化水平增加,但是不影響PKC磷酸化增加。FTI腦片出現(xiàn)CaMKII磷酸化水平增強,而不改變PKC磷酸化水平。IP3受體抑制劑2-APB能阻止SV腦片PKC磷酸化水平增加。5.CaMKII抑制劑KN93能阻斷SV腦片的IACh幅值和α7nACh受體膜蛋白水平增加。PKC抑制劑GF109203X和Go6983僅僅能阻斷SV腦片的IACh幅值增加�？偨YSV通過降低FPP水平促進GluN2B乙酰化導致NMDA受體表達增加,和促進Src介導GluN2B/2A磷酸化,導致NMDA受體活性增加。SV通過降低FPP水平促進NMDA受體介導的CaMKⅡ磷酸化,增加α7nACh受體上膜;SV增加IP3受體介導的PKC磷酸化,增強α7nACh受體活性。SV通過增強海馬Schaffer側支-CA1的α7nACh受體介導的突觸傳遞功能和NMDA受體依賴性LTP誘導,導致小鼠空間認知功能增強。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

圖１）??１２??

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圖?１?ＳＶ?ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ?ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ?ｓｐａｔｉａｌ?ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ?ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．?（Ａ）?Ｔｔｉｍｅ?ｃｈａｒｔ?ｏｆ?ｔｈｅ??ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．?ＭＷＭ，?Ｍｏｒｒｉｓ?ｗａｔｅｒ?ｍａｚｅ?ｔａｓｋ；?Ｙ，?Ｙ－ｍａｚｅ?ｔａｓｋ．?（Ｂ）?Ｉｎ?Ｍｏｒｒｉｓ?ｗａｔｅｒ??ｍａｚｅ?ｔａｓｋｓ，?ｅａｃｈ?ｐｏｉｎｔ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｔｈｅ?ｍｅａｎ?ｌａｔｅｎｃｙ?（ｓ）?（±ＳＥＭ）?ｔｏ?ｒｅａｃｈ?ｖｉｓｉｂｌｅ?ｐｌａｔｆｏｒｍ?（ｌｅｆｔ?ｓｉｄｅ）??ａｎｄ?ｈｉｄｄｅｎ?ｐｌａｔｆｏｒｍ?（ｒｉｇｈｔ?ｓｉｄｅ），?ａｎｄ?ｍｅａｎ?ｓｗｉｍ?ｓｐｅｅｄ?（ｍ／ｓ）?（ｂｏｔｔｏｍ?ｓｉｄｅ）．?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ｓｗｉｍ??ｔｒａｃｋｓ?ｉｎ?ｈｉｄｄｅｎ?ｐｌａｔｆｏｒｍ?ｔａｓｋ?ｏｎ?ｄａｙ?６?ｏｆ?ｔｒａｉｎｉｎｇ?（ｕｐｐｅｒ?ｓｉｄｅ）．?Ｂｌａｃｋ?ｄｏｔｓ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｐｌａｔｆｏｒｍ??ｐｏｓｉｔｉｏｎ．?ＡｉＴｏｗｈｅａｄｓ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｐｏｓｉｔｉｏｎ?ｗｈｅｒｅ?ｍｉｃｅ?ｗｅｒｅ?ｒｅｌｅａｓｅｄ．?＊＊Ｐ＜０．０１?ｖｅｒｓｕｓ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｍｉｃｅ??（ｒｅｐｅａｔｅｄ?ｍｅａｓｕｒｅ?ＡＮＯＶＡ）．?（Ｃ）?Ｔｙｐｉｃａｌ?ｔｒａｃｋｓ?ａｎｄ?ｈｉｓｔｏｇｒａｍ?ｓｈｏｗ?ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ?ｔｉｍｅ?ｓｐｅｎｔ?ｉｎ??３５??
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本文編號：2859606