他汀類藥作為膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl-glytarylcoenzymeA,HMG-CoA)還原酶的抑制劑已廣泛用于心血管疾病的治療。流行病學(xué)資料表明他汀類藥物服用者的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患病率有所降低。有研究報(bào)道,辛伐他汀(Simvastatin,SV)能改善阿爾茨海默動(dòng)物模型小鼠和老齡大鼠的認(rèn)知功能,但是有關(guān)其分子機(jī)制迄今仍然不清楚。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)受體是離子型谷氨酸受體的一個(gè)亞型。NMDA受體受電壓門控和遞質(zhì)門控的雙重門控通道影響。煙堿樣乙酰膽堿受體 α7亞型(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nACh受體)屬于配體門控型離子通道受體。海馬的突觸可塑性長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)被認(rèn)為是空間學(xué)習(xí)和記憶的一種細(xì)胞模式。LTP的誘導(dǎo)依賴于突觸后神經(jīng)元的NMDA受體Ca2+內(nèi)流。α7nACh受體作為Ca2+通道型受體,或通過誘導(dǎo) PI3K-Akt(phosphatidylinosito 1-3 kinase-protein kinase B)和 ERK(extracellular-signal regulated kinase)信號(hào)通路,對(duì)于海馬突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放和LTP誘導(dǎo)起到重要的調(diào)控作用。抑制HMG-CoA還原酶能降低類異戊二烯化合物水平,如焦磷酸法呢酯(farnesyl-pyrophosphate,FPP)和焦磷酸香葉酯(geranylgeranyl-pyrophosphate,GGPP)。類異戊二烯化合物通過法尼基化小G蛋白調(diào)節(jié)Ras、Rho和Rab的活性。有研究報(bào)道敲除Ras基因能促進(jìn)Src和NMDA受體亞基NR2B的磷酸化,增強(qiáng)NMDA受體活性。本課題提出SV可能通過降低類異戊二烯化合物來調(diào)控修飾NMDA受體和α7nACh受體的表達(dá)和活性,促進(jìn)海馬突觸可塑性LTP的誘導(dǎo),從而提高空間認(rèn)知功能的科研設(shè)想。因此,我們首先研究SV對(duì)海馬突觸傳遞功能和可塑性的影響,再進(jìn)一步研究SV對(duì)NMDA受體和α7nACh受體的修飾作用及其調(diào)控機(jī)制,以闡明SV促進(jìn)海馬LTP誘導(dǎo)和增強(qiáng)空間認(rèn)知功能的分子機(jī)制。研究目的1.明確SV對(duì)小鼠認(rèn)知傳遞功能和海馬突觸可塑性的影響;2.闡明SV對(duì)NMDA受體的修飾作用及其分子機(jī)制;3.闡明SV對(duì)α7nACh受體的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。材料與方法1.模型制備:(1)成年ICR雄鼠連續(xù)30天給予辛伐他汀20mg/kg/d灌胃(以下簡稱30d-SV小鼠)(第一部分實(shí)驗(yàn))；出生后25-30天的ICR乳鼠連續(xù)5天給予辛伐他汀20mg/kg/d腹腔注射(簡稱5d-SV小鼠)(第二部分實(shí)驗(yàn));(2)出生后25-30天的ICR乳鼠用SV(10μM)海馬腦片孵育4h(簡稱SV腦片)(第二和第三部分實(shí)驗(yàn));(3)法尼基轉(zhuǎn)化酶抑制劑FTI(50 mg/kg)腹腔注射(簡稱FTI小鼠);(4)法尼基轉(zhuǎn)化酶抑制劑FTI(1μmol/l)處理(簡稱FTI腦片)2.用Morris水迷宮的暗臺(tái)試驗(yàn)和軌跡試驗(yàn),Y迷宮檢查小鼠的認(rèn)知功能。3.用場電位方法檢測海馬Schaffer側(cè)支-CAl(ComuAmmonisl field)突觸傳遞(輸入-輸出曲線,I/O曲線,input-output relationship曲線),神經(jīng)遞質(zhì)釋放(雙脈沖易化,paired-pulse facilitation,PPF),長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)。4.用全細(xì)胞膜片鉗記錄檢測NMDA受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate 受體,AMPA 受體)和α7nACh受體電流。5.用Wester blot檢測海馬GluN2A、GluN2B蛋白水平,GluN2A、GluN2B、Src、PKC(protein kinas C)、PKA(protein kinas A)、CaMK II(calmodulin-kinase II)、Akt、Erk磷酸化水平。6.用 RT-PCR 檢測 GluN2A、GluN2B 表達(dá)。7.膜蛋白檢測實(shí)驗(yàn):用生物素化,提取膜蛋白,檢測α7nACh受體在膜表面的表達(dá)水平。8.免疫沉淀(IP):檢測α7nACh受體在蘇氨酸位點(diǎn)和絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平。9.染色質(zhì)免疫沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation,Chip):采用 Chip分析GluN2B基因啟動(dòng)子區(qū)的乙�；�。結(jié)果結(jié)果一 SV通過減少焦磷酸法呢酯能促進(jìn)海馬突觸傳遞和LTP,增強(qiáng)空間認(rèn)知1.連續(xù)30天SV處理(30d-SV)引起成年小鼠在水迷宮暗臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的登臺(tái)潛伏期明顯減少,在軌跡實(shí)驗(yàn)中站臺(tái)象限的游泳時(shí)間延長,以及在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)臂交替率增加,提示SV能增強(qiáng)小鼠的空間認(rèn)知功能。2.30d-SV 小鼠海馬 Schaffer 側(cè)支-CA1 的 EPSP(excitatory post-synaptic potentiation)斜率比與對(duì)照小鼠增加,伴有PPF比率降低,提示SV能促進(jìn)谷氨酸的釋放。3.與對(duì)照小鼠相比,30d-SV小鼠海馬NMDA受體依賴性LTP幅值增加——SV能增強(qiáng)LTP,NMDA受體非依賴性LTP誘導(dǎo)閾值降低——SV能易化LTP誘導(dǎo)。4.在30d-SV小鼠海馬的Akt及ERK2磷酸化水平增強(qiáng)。MLA能抑制30d-SV小鼠Akt和ERK2磷酸化水平增強(qiáng)。5.α7nACh受體阻斷劑MLA,MEK抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002能阻止30d-SV小鼠LTP誘導(dǎo)易化;MLA、U0126可阻止30d-SV小鼠LTP誘導(dǎo)增強(qiáng),而此作用不受LY294002影響。6.用法尼醇(FOH)處理30d-SV小鼠,通過補(bǔ)充焦磷酸法呢酯(FPP)水平,能阻止SV增強(qiáng)空間認(rèn)知和促進(jìn)遞質(zhì)釋放和LTP誘導(dǎo)。結(jié)果二SV通過降低FPP促進(jìn)NMDA受體的表達(dá)和活性1.連續(xù)5天SV處理(5d-SV)小鼠或者海馬腦片進(jìn)行SV孵育(SV腦片)都能增大NMDA受體電流(INMDA)的幅值,但是AMPA受體電流(IAMPA)幅值沒有明顯改變。用FOH可以阻斷SV對(duì)INMDA幅值的增強(qiáng)作用。用FTI連續(xù)5天處理小鼠(FTI小鼠)也顯示INMDA幅值增強(qiáng)。2.海馬GluN2A和GluN2B的磷酸化水平在5d-SV小鼠,SV腦片或FTI小鼠都明顯高于對(duì)照組水平。FOH可以阻斷SV對(duì)GluN2A/2B磷酸化的增強(qiáng)作用。3.與對(duì)照組相比,5d-SV 小鼠或者 FTI(Farnesyl Transferase Inhibitor)小鼠顯示GluN2B蛋白表達(dá)水平增強(qiáng),但是SV腦片GluN2B蛋白表達(dá)不改變。FOH可以阻斷SV增強(qiáng)GluN2B蛋白表達(dá)。4.SV和FTI能增加Src的磷酸化。Src抑制劑PP2能阻斷SV和FTI對(duì)INMDA幅值及GluN2A/2B磷酸化的增強(qiáng)作用,但是不影響GluN2B表達(dá)的增加。5.5d-SV小鼠或者FTI小鼠顯示GluN2B的H3K9和H3K27組蛋白乙酰化水平增加。FOH可以抑制5d-SV小鼠的GluN2B組蛋白乙�；皆黾�。結(jié)果三SV通過降低FPP增強(qiáng)α7nACh受體活性和促進(jìn)α7nACh受體上膜1.在SV腦片的海馬CA1錐體細(xì)胞,乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)電流(IACh)的幅值明顯增加,但是配體的親和力及受體脫敏半衰期沒有明顯改變,提示SV增加α7nACh受體活性。2.與對(duì)照組相比,在SV腦片α7nACh受體膜蛋白水平明顯增加,而α7nACh受體磷酸化水平?jīng)]有改變,提示SV能促進(jìn)α7nACh受體上膜。3.FOH可以阻斷SV增加IACh幅值和α7nACh受體上膜。FTI腦片顯示IACh幅值和α7nACh受體膜蛋白水平增加。4.與對(duì)照組相比,SV腦片的PKC和CaMKII磷酸化水平增加。FOH可以阻斷SV腦片的CaMKII磷酸化水平增加,但是不影響PKC磷酸化增加。FTI腦片出現(xiàn)CaMKII磷酸化水平增強(qiáng),而不改變PKC磷酸化水平。IP3受體抑制劑2-APB能阻止SV腦片PKC磷酸化水平增加。5.CaMKII抑制劑KN93能阻斷SV腦片的IACh幅值和α7nACh受體膜蛋白水平增加。PKC抑制劑GF109203X和Go6983僅僅能阻斷SV腦片的IACh幅值增加。總結(jié)SV通過降低FPP水平促進(jìn)GluN2B乙�；瘜�(dǎo)致NMDA受體表達(dá)增加,和促進(jìn)Src介導(dǎo)GluN2B/2A磷酸化,導(dǎo)致NMDA受體活性增加。SV通過降低FPP水平促進(jìn)NMDA受體介導(dǎo)的CaMKⅡ磷酸化,增加α7nACh受體上膜;SV增加IP3受體介導(dǎo)的PKC磷酸化,增強(qiáng)α7nACh受體活性。SV通過增強(qiáng)海馬Schaffer側(cè)支-CA1的α7nACh受體介導(dǎo)的突觸傳遞功能和NMDA受體依賴性LTP誘導(dǎo),導(dǎo)致小鼠空間認(rèn)知功能增強(qiáng)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

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本文編號(hào)：2859606