前言:經(jīng)典的噻唑烷二酮類藥物如羅格列酮(Rosi)作為治療二型糖尿病的常用藥物,由于其常伴有較多甚至嚴(yán)重的不良反應(yīng)而限制了其在臨床的使用。因此,我們前期研究合成了激動(dòng)PPARγ能力較弱的CMHX008,前期發(fā)現(xiàn)其具有與Rosi相似的胰島素增敏作用的同時(shí)對(duì)心臟、骨骼、體重較Rosi顯示出更好的安全性。糖尿病腎病為糖尿病的主要并發(fā)癥之一,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,Rosi對(duì)糖尿病腎病顯示出抗纖維化作用,但CMHX008對(duì)糖尿病腎病的影響并不清楚。本研究旨在以Rosi為對(duì)照,探討新型PPARγ激動(dòng)劑CMHX008(C)對(duì)糖尿病腎病的影響及機(jī)制。方法:采用高脂飲食誘發(fā)的2型糖尿病小鼠為模型,隨機(jī)分為:高脂空白組(HV組)、羅格列酮組(HR組)、CMHX008組(HC組),低脂喂養(yǎng)的小鼠給予等量溶媒作為低脂空白組(LV組)。收集各組小鼠尿液及血清行全自動(dòng)生化分析檢測,HE染色觀察腎臟組織形態(tài),天狼星紅和Masson染色顯示腎臟組織的膠原纖維存積,RT-PCR檢測α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、E-鈣粘蛋白、I型膠原纖維及纖連蛋白mRNA在腎臟的相對(duì)表達(dá)量;Rosi和C處理30mM/L葡萄糖條件下培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞,采用CCK-8法檢測不同藥物濃度處理后各組HK-2細(xì)胞的存活率,免疫印跡法檢測纖維化標(biāo)志蛋白和磷酸化PPARγ(ser273)的表達(dá),qRT-PCR檢測纖維化標(biāo)志物mRNA的表達(dá),劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測不同處理組HK-2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果:HR組和HC組的尿蛋白/肌酐比值(Upro/Cr)較HV組減少,HC組血清中的尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)濃度顯著減少,提示CMHX008和羅格列酮對(duì)肥胖小鼠腎臟功能損傷有改善作用;蘇木精-伊紅(HE)染色表明,與HV組相比,HR和HC組腎小管損傷明顯改善;天狼星紅及Masson染色顯示HR組及HC組腎臟的纖維化存積較HV組明顯減少;RT-PCR結(jié)果顯示,與HV組比較,HR組、HC組間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、Collagen I、Fibronectin mRNA表達(dá)顯著下調(diào),上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad mRNA表達(dá)顯著上調(diào);從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)CCK-8法的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)3μmol/L Rosi和3μmol/L C均對(duì)HK-2細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性,免疫印跡法顯示給與Rosi和C能逆轉(zhuǎn)高糖條件下PPARγser273位點(diǎn)磷酸化的上調(diào),減少TGF-β1、α-SMA的表達(dá),增加E-cad的表達(dá),劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示Rosi和C改善高糖引起HK-2細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)。結(jié)論:與Rosi類似,新型PPARγ激動(dòng)劑C能改善小鼠糖尿病引起的腎功能減弱,抑制長期高脂誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟的纖維化和高糖引起的人腎小管上皮細(xì)胞纖維化標(biāo)志物的上調(diào),提示CMHX008有改善糖尿病引起的腎臟纖維化的作用,其機(jī)制可能與抑制PPARγ絲氨酸273位點(diǎn)的磷酸化有關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

通過對(duì)羅格列酮的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，我們合成了新型 TZDs 類 PPARγ激動(dòng)劑CMHX008（Fig 1）,其對(duì) PPARγ的激動(dòng)能力較羅格列酮弱，但具有與羅格列酮相似的胰島素增敏和促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的作用[18]。Choi 等研究表明在高脂條件下，脂肪細(xì)胞中 CDK5 介導(dǎo)的 PPARγ的磷酸化明顯增加，抗糖尿病藥物羅格列酮通過抑制脂肪細(xì)胞中 CDK5 介導(dǎo)的 PPARγSer273 位點(diǎn)的磷酸化來增加胰島素對(duì)葡萄糖的敏感性，進(jìn)而發(fā)揮體內(nèi)維持正常葡萄糖水平的作用[19]。通過研究發(fā)現(xiàn)，CMHX008可以抑制肥胖小鼠脂肪組織中 PPARγSer273 位點(diǎn)的磷酸化，對(duì)骨量丟失的程度較羅格列酮明顯減輕[20]。那么，在糖尿病腎病中，PPARγ部分激動(dòng)劑 CMHX008 對(duì)腎臟功能的改善是否與 PPARγSer273 位點(diǎn)磷酸化有關(guān)。因此，本研究旨將以傳統(tǒng)胰島素增敏藥物羅格列酮作為陽性對(duì)照，采用高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型和高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮 HK-2 細(xì)胞為模型進(jìn)行研究,闡明 CMHX008 是否能夠改善 2 型糖尿病引起的腎臟功能減弱，減弱腎臟纖維化的發(fā)生，以及糖尿病腎病的改善作用與 ser273 位點(diǎn) PPARγ的磷酸化的關(guān)系。

分析檢測結(jié)果顯示（Tab 2），與 LV 組比較，HV 組小鼠尿液 Na+濃度明顯降低；與 HV 組比較，HR 組 Na+濃度無明顯改善，HC 組 Na+濃度明顯增加。腎損傷通常是無癥的，由蛋白尿、血尿或者腎小球?yàn)V過率 GFR 的減少表示[5]。Tab 2、3 結(jié)果表明，與 LV 組比較，HV 組小鼠 Upro 濃度、Upro/Cr 比值、Scr 濃度明顯上升，表明長期高脂飲食喂養(yǎng)會(huì)影響小鼠腎臟對(duì) Upro、Scr 的排泄，造成腎臟的損傷。通過 16 周的長期給藥，與 HV 組比較，HR 組、HC 組 Upro 濃度減少約 40%、50%；HR、HC 組 Upro/Cr 比值均減少約 50%（Tab 3）。分析小鼠血清各指標(biāo)結(jié)果顯示（Tab 4），與 HV 組比較，HR 組 Scr 濃度明顯增加，而 BUN 的濃度較 HV 組差異無顯著性；HC 組 BUN、Scr 濃度明顯減少，表明 CMHX008 較羅格列酮能更加有效降低血清中尿素氮、血肌酐水平。結(jié)果表明，羅格列酮和CMHX008 對(duì)高脂誘發(fā)的 2 型糖尿病小鼠腎功能受損有改善作用，CMHX008 較羅格列酮改善更為明顯。

圖 3 腎臟 H&E、天狼星紅染色及 Masson 染色(X400)。LV:低脂空白組；HV：高脂空白組；HR：羅格列酮組；HC：CMHX008 組。Fig 3 H&E, Sirius red and Masson’s trichrome staining of kidney tissues (×400). LV：lowfat-diet group; HV: high fat-diet group; HR: rosiglitazone group; HC: CMHX008 group.2.3 羅格列酮和 CMHX008 對(duì)腎臟纖維化改善作用可能與腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的減弱有關(guān)檢測腎臟組織中相關(guān)分子 mRNA 相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)（Fig 4A-D），與 LV 組比較，HV 組間基質(zhì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I 型膠原纖維（Collagen I）、纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，上皮標(biāo)志蛋白 E-鈣蛋白（E-cadherin，E-Cad）mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)；與 HV 組比較，HR組α-SMA、Collagen I、Fibronectin mRNA 的表達(dá)明顯下調(diào)，E-cad mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，HC 組α-SMA、Collagen I、Fibronectin mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，E-cad mRNA
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本文編號(hào)：2850145