研究背景:青稞,作為一種高原谷物,是青藏高原高寒農(nóng)業(yè)區(qū)的主要糧食作物,其β-葡聚糖含量高于其他各類谷物。β-葡聚糖是一種可溶性膳食纖維,由吡喃型葡萄糖通過β-(1→3)以及β-(1→4)糖苷鍵交替連接而成。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道谷物中的β-葡聚糖擁有良好的降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化甚至是抗腫瘤的作用。近年來,隨著生活水平的提高,高血脂及其引發(fā)的心血管疾病的發(fā)病率不斷上升,嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。作為一種天然多糖,β-葡聚糖具備良好降血脂活性,且主要來源于人們?nèi)粘Ｉ钪械闹魇?安全性能高,毒副作用極少,存在巨大的開發(fā)價(jià)值,是一種亟待開發(fā)的理想藥品或保健品資源。然而,當(dāng)前β-葡聚糖的提取工藝繁瑣,產(chǎn)品純度不高,產(chǎn)率較低,序列解析較難是限制其應(yīng)用推廣的主要原因。此外,β-葡聚糖降血脂活性的作用機(jī)制尚不明確,是限制其臨床推廣的另一大瓶頸。目的:(1)通過參數(shù)的優(yōu)化,確立一套流程簡單、產(chǎn)率合適且純度較高的制備工藝;(2)建立一個(gè)迅速、靈敏的分離分析方法對該工藝條件下制備所得青稞β-葡聚糖結(jié)構(gòu)及其寡糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效分析;(3)對該工藝條件下制備所得的青稞β-葡聚糖的降血脂活性及其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索,為青稞β-葡聚糖在臨床上應(yīng)用的推廣提供依據(jù)。方法:(1)采用單糖組成分析法對制備過程中雜質(zhì)多糖進(jìn)行監(jiān)測,優(yōu)化流程中沉淀劑濃度,完善工藝條件;(2)采用硫酸苯酚法測定樣品中總糖含量,采用核磁共振法確定樣品構(gòu)型,通過單糖組成分析、總糖含量測定以及核磁共振分析對該工藝條件下制備所得樣品進(jìn)行較為全面的鑒定;(3)采用高效葡聚糖凝膠色譜串聯(lián)多角度激光散射-示差檢測器(SEC-MALLS-RI)對該工藝條件下制備得到的青稞β-葡聚糖分子量分布進(jìn)行分析;(4)建立一個(gè)簡單、靈敏并且高效的分離分析方法,將HPAEC-PAD與Q-TOF串聯(lián),對青稞β-葡聚糖及酶解其寡糖進(jìn)行序列解析;(5)建立合適體外模型,對青稞β-葡聚糖體外膽酸結(jié)合能力進(jìn)行測定;(6)通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步確認(rèn)青稞β-葡聚糖降血脂作用,并通過western blot分析方法對其可能機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),沉淀劑硫酸銨溶液的濃度是最終產(chǎn)物葡聚糖的產(chǎn)率和純度的主要影響因素。硫酸銨溶液濃度越大,產(chǎn)率越高,但純度越低。綜合考慮產(chǎn)率以及純度的兩方面因素,最終確認(rèn)制備工藝中采用25%硫酸銨溶液作為沉淀劑最佳,該工藝條件下產(chǎn)物中主要單糖組成為葡萄糖,產(chǎn)率為2.8%。(2)硫酸苯酚法測定提取產(chǎn)物中總糖含量≥99.6%,蛋白等雜質(zhì)的含量極低;13C-NMR結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了產(chǎn)物中葡聚糖均為β型葡聚糖,無α-型葡聚糖的存在,此結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)該工藝的可行性。(3)通過SEC-MALLS-RI對產(chǎn)物的分子量分布分析,可得青稞β-葡聚糖分子量范圍為794796.2 Da(±4.7%),分散系數(shù)Mw/Mn 2.445(±6.772%),分子量較大且分布較為集中。(4)創(chuàng)新性地將HPAEC-PAD與Q-TOF串聯(lián)應(yīng)用于青稞β-葡聚糖寡糖序列解析,所得EIC譜圖與PAD譜圖中各峰位的歸屬結(jié)果相互對應(yīng),該方法高效迅速地對β-葡聚糖寡糖進(jìn)行了有效的分離與分析。(5)HPAEC-PAD-MS/MS的結(jié)果顯示,青稞β-葡聚糖酶解后寡糖分布存在一定特點(diǎn),若各寡糖聚合度分別用dp3n,dp3n+1,dp3n+2表示,則dp3n一般存在兩種序列連接方式,分別表示為[Glc1→4Glc1→4Glc]n和[Glc1→3Glc1→4Glc]n;dp3n+1是每一個(gè)周期中豐度最高的寡糖,其連接方式可表示為[Glc1→3Glc1→4Glc]n1→4Glc;而dp3n+2的寡糖含量相對較少,它一般由均一的β-(1→4)糖苷鍵連接而成。(6)通過體外降血脂活性評價(jià)實(shí)驗(yàn),確認(rèn)β-葡聚糖存在一定的膽酸結(jié)合能力,且隨著葡聚糖濃度的增加,其膽酸結(jié)合率越高。(7)通過體內(nèi)降血脂活性評價(jià)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步確認(rèn)青稞β-葡聚糖的降血脂作用,青稞β-葡聚糖可顯著降低小鼠體內(nèi)TC、TG以及LDL-C水平,適當(dāng)增加小鼠體內(nèi)HDL-C水平,此外β-葡聚糖還可通過增加小鼠體內(nèi)GSH-Px以及SOD抗氧化酶的活性,降低MDA水平,通過抗氧化方式達(dá)到對機(jī)體的保護(hù)作用。(8)綜合體外降血脂活性評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及western blot結(jié)果可初步確認(rèn)β-葡聚糖的降血脂機(jī)制。Western blot結(jié)果顯示β-葡聚糖可上調(diào)CYP7A1蛋白的表達(dá),而上述體外實(shí)驗(yàn)表明β-葡聚糖可與膽酸發(fā)生有效的結(jié)合。由此可知,β-葡聚糖通過增加膽酸的排泄,上調(diào)限速酶CYP7A1的表達(dá),促進(jìn)肝臟中膽固醇代謝為膽汁酸這一過程,并最終達(dá)到降低膽固醇及LDL-C水平的目的。結(jié)論:本課題成功確立了一套青稞β-葡聚糖的提取純化工藝,該方法制備的青稞β-葡聚糖具有純度高、產(chǎn)率高的特點(diǎn)并擁有良好降血脂活性;同時(shí)建立了有效的β-葡聚糖結(jié)構(gòu)解析的方法,對青稞β-葡聚糖分子量分布以及糖鏈上寡糖分布特征進(jìn)行有效評估,其中值得注意的是,HPAEC-PAD-MS/MS方法具有簡便、快速、靈敏、高效等優(yōu)點(diǎn);本課題還探討了該工藝條件下制備所得的青稞β-葡聚糖的降血脂活性,并從蛋白水平探索可能的作用機(jī)制,確認(rèn)β-葡聚糖可通過促進(jìn)膽酸的排泄,上調(diào)CYP7A1蛋白的表達(dá),促進(jìn)膽固醇代謝為膽汁酸這一過程,最終達(dá)到降低血脂的目的。藥食同源逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn),該實(shí)驗(yàn)一方面可為今后的新藥研發(fā)、生產(chǎn)或質(zhì)量控制等提供科學(xué)依據(jù);另一方面由于β-葡聚糖廣泛存在各類食物(如青稞、燕麥等)中,通過增加該類糧作物的攝入,可有效預(yù)防或控制高血脂的發(fā)生和發(fā)展,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為今后人們?nèi)粘ｏ嬍程峁┯辛⒖肌?br> 【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R943;R96
【部分圖文】：

測確定化合物分子量。其中，MALLs 是指十八角度激光散射儀，Wyatt 總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的關(guān)系，并確定散射光與分子量、濃度以及折射率增量的平方當(dāng)溶液折射率、濃度以及散射光已知的情況，便可以有效求出溶液中樣品分，見圖 6。因此多角度激光散射儀通過對散射光的檢測，可快速準(zhǔn)確地對任物質(zhì)進(jìn)行分子量分布分析，無需任何標(biāo)準(zhǔn)品作參照。綜上所述，其中 SEC 可將混合物中不同分子量范圍的物質(zhì)進(jìn)行有效分離，脫下來的不同成分進(jìn)行有效的濃度檢測，MALLS 可對各洗脫成分的分子量[61]，因而 SEC-MALLS-RI 可對溶液中各洗脫成分的分子量分布進(jìn)行快速有。當(dāng)前，該方法已廣泛用于肝素、舒洛地特等多糖的分子測定，簡單、迅速4.1.2 分子量測定結(jié)果該課題采用體積排阻色譜法串聯(lián)多角度激光光散射檢測器-示差折光檢測器C-MALLS-RI)對制備所得樣品進(jìn)行分子量的測定，具體結(jié)果如圖 7：

糖的制備、結(jié)構(gòu)解析及其降血脂活性的研究 第三章 青稞 β-葡聚量分布較為集中，主要以一個(gè)片段的形式分布。實(shí)驗(yàn)過程中，dn/dc RA軟件分析，計(jì)算得青稞 β-葡聚糖分子量分布范圍為 794796.2 D Mw/Mn 2.445 (±6.772%)。可知，采用該工藝制備得到的 β-葡聚糖分子量約為 800kDa，分子較為集中，說明制備過程中，β-葡聚糖未發(fā)生顯著降解作用，糖鏈 β-葡聚糖序列結(jié)構(gòu)解析，HPAEC-PAD 可提供高效的分離作用以及靈敏的檢測作用，但是品的對照才可實(shí)現(xiàn)峰的歸屬，極大限制其應(yīng)用，而質(zhì)譜可快速、靈的結(jié)構(gòu)、序列方面的信息，該課題的創(chuàng)新性就在于將 HPAEC-PAD對 β-葡聚糖寡糖的有效的序列解析，具體流程見圖 8。.1 β-葡聚糖寡糖的分離分析

糖的制備、結(jié)構(gòu)解析及其降血脂活性的研究 第三章 青稞 β-葡聚量分布較為集中，主要以一個(gè)片段的形式分布。實(shí)驗(yàn)過程中，dn/dc RA軟件分析，計(jì)算得青稞 β-葡聚糖分子量分布范圍為 794796.2 D Mw/Mn 2.445 (±6.772%)。可知，采用該工藝制備得到的 β-葡聚糖分子量約為 800kDa，分子較為集中，說明制備過程中，β-葡聚糖未發(fā)生顯著降解作用，糖鏈 β-葡聚糖序列結(jié)構(gòu)解析，HPAEC-PAD 可提供高效的分離作用以及靈敏的檢測作用，但是品的對照才可實(shí)現(xiàn)峰的歸屬，極大限制其應(yīng)用，而質(zhì)譜可快速、靈的結(jié)構(gòu)、序列方面的信息，該課題的創(chuàng)新性就在于將 HPAEC-PAD對 β-葡聚糖寡糖的有效的序列解析，具體流程見圖 8。.1 β-葡聚糖寡糖的分離分析
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