丙泊酚是一種廣泛使用的靜脈麻醉劑,靜脈注射時有很高的幾率出現(xiàn)注射痛,表明它具有致痛作用。然而,在幾個研究中,表明丙泊酚具有抗傷害作用。研究顯示丙泊酚降低初級感覺神經(jīng)傳入纖維的神經(jīng)興奮性。在福爾馬林實驗的Ⅰ相和Ⅱ相,局部注射丙泊酚產(chǎn)生劑量依賴性的抗傷害效果。另一項實驗證實,聯(lián)合注射丙泊酚可以抑制蜂毒導致的疼痛行為。在小鼠的腹腔內(nèi)注射丙泊酚,可以抑制醋酸導致的扭體反應,該機制被證實是通過脊髓途徑介導的。辣椒素受體,又名瞬時感受器電位香草酸1亞型(transient receptor potential vanilloid subtype-1, TRPV1),在疼痛的信號傳遞中扮演著十分重要的作用,并且在小鼠的炎癥性熱痛覺過敏的發(fā)展中是不可或缺的一環(huán),激活TRPV1是內(nèi)臟痛中非常重要的步驟。使用TRPV1拮抗劑或者對新生小鼠注射辣椒素的辦法來清除TRPV1神經(jīng)元,都能抑制之后使用醋酸導致的扭體反應。包括內(nèi)皮素、前列腺素和緩激肽在內(nèi)的一系列因子,主要通過蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)或者蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)途徑的磷酸化來敏化TRPV1。研究證實,丙泊酚增強脊髓背根神經(jīng)節(jié)細胞對辣椒素的敏感性,是通過瞬時感受器電位錨蛋白1亞型(transient receptor potential ankyrin receptor subtype-1, TRPA1)和PKCs介導的TRPV1磷酸化實現(xiàn)的。從理論上推理,腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚和TRPV1激動劑會因為丙泊酚對TRPV1的敏化作用導致內(nèi)臟痛增強,而這又和之前研究證實的丙泊酚抗傷害作用相矛盾。因此,我們在小鼠腹腔內(nèi)注射丙泊酚聯(lián)合醋酸或辣椒素,觀察其傷害反應來研究這一效果。1材料和方法1.1實驗動物動物本研究均選用鼠齡6-8周,雄性C57BL/6J小鼠,體重20-22g,購置于中山大學醫(yī)學院實驗動物中心(中國,廣州)。小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體(specefic pathogen free, SPF)自動調(diào)溫、調(diào)濕的動物實驗室中,自由飲水、進食,一天內(nèi)12 h光照,室溫控制在22±1℃,自由飲食,飼養(yǎng)環(huán)境為12h晝夜節(jié)律變換,濕度控制在50%-70%的環(huán)境中。本研究中實驗動物的使用及處理方法均符合廣東省醫(yī)學科學院動物實驗倫理委員會的要求,并嚴格按照規(guī)定減少動物痛苦,盡可能減少實驗動物的使用數(shù)量。1.2實驗材料丙泊酚(2,6-二異丙基苯酚)和辣椒素都購置于Sigma公司(美國,密蘇里州,圣路易斯),并溶解于二甲亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)作為貯存溶液。醋酸和硫酸鎂購置于杭州化學試劑公司(中國,浙江)。所有的藥物在使用前都經(jīng)過生理鹽水稀釋。1.3腹腔內(nèi)注射醋酸、硫酸鎂和辣椒素引起的疼痛行為學觀察小鼠于實驗前放置于透明有機玻璃盒(22 cm×12 cm×10 cm)內(nèi)預適應30min。30min后從盒子里取出,用胰島素注射針(30G針頭)腹腔注射0.01ml/g的0.6%醋酸和5mM丙泊酚的混合溶液(對照組2.5% DMSO+0.01ml/g的0.6%醋酸)、0.6mg/g的6mg/ml硫酸鎂和5mM丙泊酚的混合溶液(對照組2.5%DMSO+0.6mg/g的6mg/ml硫酸鎂)或者200uM辣椒素與5mM丙泊酚的混合溶液(對照組4.5% DMSO+200uM辣椒素),腹腔注射藥物后立即放入有機玻璃盒內(nèi)進行觀察,整個過程要注意減少對動物的刺激,特別是腹腔注射動作要輕柔,以免刺激小鼠致其活動量減少,影響行為學的觀察。觀察并用手動計數(shù)器記錄每只動物腹腔注射醋酸和硫酸鎂混合溶液后30 mmin內(nèi)小鼠扭體反應的次數(shù)(如腹部收縮、扭動軀干、弓背、伸展后肢等)和用秒表計時器記錄腹腔注射辣椒素后10min內(nèi)小鼠傷害反應的總時間(如低頭彎腰縮成團的姿勢、腹部朝上臥倒的姿勢)。一只動物只作一次實驗,每組有10只小鼠。一次同時觀察4只小鼠,處理組和對照組各2只。為盡可能減小晝夜時間因素對小鼠相關行為的影響,本研究中所有動物行為學實驗均在9：00至17：00之間進行。1.4去除TRPV1神經(jīng)元小鼠的制備雄性新生小鼠于出生后第二天七氟醚麻醉后皮下注射辣椒素(50 mg/kg),對照組注射同樣容量的溶劑(PBS含10%ethanol與10% Tween-80),動物在SPF動物房里面飼養(yǎng)6周后進行實驗。新生期注射辣椒素能夠去除表達TRPV1神經(jīng)元,用角膜刺激實驗驗證去除TRPV1神經(jīng)元的效果,用0.01%辣椒素20 ul噴到小鼠眼睛上,小鼠會用前肢拂拭眼睛,記數(shù)1 min內(nèi)用前肢拂拭眼睛的次數(shù),如1 min內(nèi)用前肢拂拭眼睛的次數(shù)少于5次就認為已經(jīng)成功去除TRPV1神經(jīng)元。1.5統(tǒng)計分析使用Windows版Minitab 16(美國,賓夕法尼亞州,Minitab公司)進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,正態(tài)分布且方差齊時,行獨立樣本t檢驗,P0.05認為有統(tǒng)計學顯著差異。2結(jié)果2.1腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚增加醋酸引起的扭體反應使用2mM的丙泊酚聯(lián)合總量為0.01ml/g的0.6%醋酸在小鼠腹腔內(nèi)注射后發(fā)現(xiàn),與單獨注射0.01ml/g的0.6%醋酸相比,每5分鐘的扭體反應數(shù)量沒有差距,而30分鐘內(nèi)實驗組總體的小鼠扭體反應比對照組要高,分別為53.5+9.2次和40.3±3.6次(P=0.02)。但是兩組之間在發(fā)生扭體反應的潛伏期上沒有統(tǒng)計學差異,分別為141±10秒和116±8秒,(P=0.47)。腹腔內(nèi)注射5mM丙泊酚不引起小鼠的傷害反應。腹腔內(nèi)注射0.6%醋酸引起小鼠30分鐘內(nèi)31±6.9次的扭體反應,并且潛伏期少于2分鐘。我們的觀察證實了注射醋酸后的扭體反應主要發(fā)生在30分鐘內(nèi)。聯(lián)合注射5mM丙泊酚和0.6%醋酸使小鼠30分鐘內(nèi)的扭體反應增加到42.8±9.2次(P0.05)。2.2腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚增加硫酸鎂引起的扭體反應腹腔內(nèi)注射6mg/ml硫酸鎂0.6mg/g引起小鼠30分鐘內(nèi)13.7±2.9次的扭體反應,聯(lián)合注射5mM丙泊酚后,使小鼠30分鐘內(nèi)的扭體反應增加到25.3±4.8次(P0.001)。2.3腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚減少辣椒素導致的傷害反應時間腹腔內(nèi)注射200μM辣椒素后10秒內(nèi)導致小鼠的傷害反應時間為371±82.7秒,這些反應10分鐘后消失。腹腔內(nèi)聯(lián)合注射200μM辣椒素和5mmM丙泊酚后,小鼠的傷害反應時間大幅度縮短至67±39秒(P0.05)。2.4 TRPVl對腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚的影響為了明確TRPVl對丙泊酚在致痛物質(zhì)引起的小鼠傷害反應中的作用,給出生2天的小鼠皮下注射50mg/kg辣椒素,當它們成年后再腹腔內(nèi)注射醋酸、硫酸鎂或者辣椒素。經(jīng)過辣椒素處理后的成年小鼠,腹腔內(nèi)注射6mg/ml硫酸鎂和200λM辣椒素后沒有任何的腹部向上臥倒或者低頭彎腰坐立的傷害反應；腹腔內(nèi)注射0.6%醋酸后,30分鐘內(nèi)的扭體反應為20±4.1次,顯著少于對照組經(jīng)過溶媒處理后成年小鼠腹腔內(nèi)注射0.6%醋酸后30分鐘內(nèi)的扭體反應33±5.8次；腹腔內(nèi)聯(lián)合注射5mM丙泊酚和0.6%醋酸后,30分鐘內(nèi)的扭體反應為16±3.9次,顯著少于單純注射0.6%醋酸后30分鐘內(nèi)的扭體反應21±3.6次。本研究中腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚時,醋酸誘導的扭體反應增加,表明丙泊酚具有促傷害作用。已有研究證實,腹腔內(nèi)注射醋酸主要通過TRPV1介導導致扭體反應。所以,經(jīng)大劑量辣椒素處理清除了TRPV1的新生小鼠成年后,向其腹腔內(nèi)注射醋酸導致的扭體反應顯著減少。TRPV1是一種依賴鈣離子的非選擇性陽離子通道,可以被辣椒素、質(zhì)子、陽離子、傷害性溫度刺激和包括脂質(zhì)代謝產(chǎn)物在內(nèi)的內(nèi)源性配體直接激活。在包括內(nèi)皮素和緩激肽在內(nèi)的“炎癥池”物質(zhì)聯(lián)合作用下,可以降低TRPV1的激活閾值。從小靜脈注射丙泊酚時,經(jīng)常導致注射痛,緩激肽和前列腺素在其中發(fā)揮重要的作用。對大鼠背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元使用較大劑量的TRPV1激動劑導致TRPV1的敏感性下降,而丙泊酚可以通過PKCε和TRPA1途徑使其敏感性恢復。在基因敲除B1和B2的小鼠中,醋酸導致的內(nèi)臟傷害反應大約減少70%�？梢�,丙泊酚也許是通過敏化TRPV1增強了醋酸的傷害作用。然而,很難解釋相同劑量的丙泊酚會減弱辣椒素的傷害反應。一些研究證實,全身注射大劑量的丙泊酚在導致正常反射消失外,還會產(chǎn)生止痛作用,而全身注射亞催眠劑量的丙泊酚會產(chǎn)生致痛作用。腹腔內(nèi)注射亞催眠劑量的丙泊酚,或者側(cè)腦室和中腦導水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)注射微量的丙泊酚會產(chǎn)生顯著的致痛作用,這一結(jié)論已通過清醒大鼠的熱板痛覺實驗和福爾馬林實驗所證實,而椎管內(nèi)注射丙泊酚顯示出良好的止痛作用。因此,人們認為丙泊酚通過脊髓上機制產(chǎn)生致痛作用。熱板痛覺試驗表明,小鼠腹腔內(nèi)注射丙泊酚產(chǎn)生抗傷害作用,而醋酸導致的小鼠扭體反應是通過N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, AMPA)途徑完成的。聯(lián)合注射丙泊酚可以抑制蜂毒導致的疼痛反應。綜上所述,丙泊酚使用的劑量和途徑?jīng)Q定了產(chǎn)生止痛作用還是致痛作用。與之前的研究不同,我們的研究發(fā)現(xiàn),腹腔內(nèi)聯(lián)合注射相同劑量的丙泊酚同時表現(xiàn)出致痛作用和止痛作用。它增加了醋酸和硫酸鎂導致的扭體反應,同時也降低了辣椒素導致的傷害時間。我們的研究顯示,經(jīng)過辣椒素處理的新生小鼠,成年后聯(lián)合注射丙泊酚和醋酸的扭體反應減少,與丙泊酚的TRPV1作用有關。丙泊酚鼻內(nèi)輸注導致的疼痛反應和動脈內(nèi)注射導致的屈肌反射都是由TRPA1介導的。只有表達TRPA1的神經(jīng)元,丙泊酚才能引起內(nèi)向電流,而對于轉(zhuǎn)染了TRPV1的HEK293細胞,丙泊酚并不能引起內(nèi)向電流。有研究表明,丙泊酚不能改變辣椒素和TRPV1的結(jié)合反應。然而,另一個研究證明,丙泊酚使轉(zhuǎn)染了Wistar大鼠TRPV1 cDNA的HEK293細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。對于轉(zhuǎn)染了人TRPV1 cDNA的HEK293細胞,聯(lián)合使用辣椒素和丙泊酚的內(nèi)向電流反而比單獨使用辣椒素的內(nèi)向電流小。這些研究都表明丙泊酚和TRPV1之間有著功能上的關聯(lián)。某些激動劑直接與TRPV1結(jié)合的同時,也起到強化介質(zhì)的作用。例如,輕微的酸性環(huán)境能降低TRPV1的溫度閾值并增強熱刺激和辣椒素導致的電流。雞的TRPV1對辣椒素不敏感,但是高濃度的辣椒素可以增強質(zhì)子激發(fā)的電流。當不同物質(zhì)對同一受體的結(jié)合位點有重合時,會導致競爭性拮抗,例如,陽離子和質(zhì)子都作用于TRPV1上的E600和E648區(qū)域。鎂離子在1-10mM的環(huán)境下敏化TRPV1,在5-10mM的環(huán)境下阻止了TRPV1與質(zhì)子的反應。丙泊酚可能在細胞膜內(nèi)和TRPV1發(fā)生作用,或者與TRPV1穿越脂質(zhì)雙分子層的疏水區(qū)相結(jié)合,因為丙泊酚是脂溶性的并且具有穿透細胞膜的能力。3結(jié)論我們的研究發(fā)現(xiàn),腹腔內(nèi)注射制造的小鼠內(nèi)臟痛模型中,TRPV1存在時,丙泊酚增加了醋酸和硫酸鎂誘導小鼠的扭體反應,同時減少了辣椒素誘導小鼠的傷害反應時間,而TRPV1滅活后,硫酸鎂和辣椒素不能誘導小鼠的傷害反應,醋酸誘導的扭體反應減少,聯(lián)合注射丙泊酚進一步減少了醋酸誘導的小鼠扭體反應,提示丙泊酚和TRPV1的結(jié)合位點可能與辣椒素和TRPV1的結(jié)合位點重合,因此,丙泊酚在聯(lián)合使用辣椒素時表現(xiàn)出抗傷害作用。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R96
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
1. 材料與方法
    1.1 實驗動物
    1.2 實驗材料
    1.3 腹腔內(nèi)注射醋酸、硫酸鎂和辣椒素引起的疼痛行為學觀察
    1.4 去除TRPV1神經(jīng)元小鼠的制備
    1.5 統(tǒng)計學方法
2 結(jié)果
    2.1 腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚增加醋酸引起的扭體反應
    2.2 腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚增加硫酸鎂引起的扭體反應
    2.3 腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚減少辣椒素導致的傷害反應時間
    2.4 TRPV1對腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚的影響
3 討論
    3.1 腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚增加醋酸誘發(fā)的扭體反應
    3.2 不同途徑和劑量的丙泊酚可產(chǎn)生止痛作用或者致痛作用
    3.3 硫酸鎂作用于TRPV1的機制
    3.4 丙泊酚的作用位點
4. 結(jié)論
參考文獻
中英文縮略字對照表
攻讀學位期間成果
致謝

【共引文獻】

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本文編號：2847867