發(fā)布時(shí)間：2020-10-20 04:56

　　 非昔羅霉素(Ficellomycin)是從細(xì)繩鏈霉菌(Streptomyces ficellus NRRL8067)的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得的一種類二肽化合物,由一個(gè)纈氨酸和一個(gè)特殊的氨基酸(類似精氨酸)通過肽鍵縮合而成。非昔羅霉素能夠特異性地作用于DNA半保留復(fù)制過程中形成的岡崎片段(34S),阻止其進(jìn)一步拼接形成完整的染色體DNA,從而抑制細(xì)胞的分裂,但對(duì)正常細(xì)胞的生理代謝活動(dòng)沒有影響。近年來,非昔羅霉素以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制,受到了廣泛關(guān)注,但對(duì)其生物合成途徑以及分子結(jié)構(gòu)中一些重要官能團(tuán)的催化合成機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。目前本課題組已經(jīng)從細(xì)繩鏈霉菌中分離出了非昔羅霉素的生物合成基因簇,經(jīng)過生物信息學(xué)分析,該基因簇大約30 kb左右,包含26個(gè)開放閱讀框。其中nrps基因、谷氨酰胺鯊肌醇轉(zhuǎn)氨酶基因等已經(jīng)確定是非昔羅霉素生物合成所必須的基因,但仍有部分基因未確定。因此本研究通過基因阻斷及回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)基因fic27(功能未知)、基因fic28(磺�；D(zhuǎn)移酶)、基因sul1/sul2(腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)進(jìn)行進(jìn)一步研究,同時(shí)對(duì)非昔羅霉素中重要官能團(tuán)氮雜環(huán)丙烷(aziridine)的生物合成機(jī)制進(jìn)行了研究及分析。通過基因阻斷及回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明:基因fic27(功能未知)、基因fic28(磺�；D(zhuǎn)移酶)、基因sul1/sul2(腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)均參與了非昔羅霉素的生物合成,是其生物合成所必須的基因。其中,腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因在完整的染色體中存在兩個(gè)(基因fic17/fic18和基因sul1/sul2),阻斷其中一個(gè)仍能產(chǎn)生非昔羅霉素但產(chǎn)量減少,全部阻斷后不能產(chǎn)生非昔羅霉素,證明均參與了非昔羅霉素的合成。通過對(duì)基因fic28(磺�；D(zhuǎn)移酶)在大腸桿菌Rosseta(Escherichia coli Rosseta)的異源表達(dá)對(duì)重要官能團(tuán)氮雜環(huán)丙烷的生物合成機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),磺酸基轉(zhuǎn)移酶的最適催化反應(yīng)溫度為37℃C且酶的穩(wěn)定性較好。通過底物選擇性及酶催化反應(yīng)分析得出氮雜環(huán)丙烷可能先于氮雜雙環(huán)中五元環(huán)形成,但需進(jìn)一步驗(yàn)證。初步分離純化發(fā)酵液中非昔羅霉素,進(jìn)行抗菌譜分析。采用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種菌株為指示菌進(jìn)行生物活性檢測(cè),得出非昔羅霉素對(duì)金黃色葡萄球菌以及耐藥性金黃色葡萄球菌(包括耐青霉素、耐鏈霉素、耐紅霉素)、枯草芽孢桿菌、草酸青霉、雷斯青霉、藍(lán)色犁頭酶有抑制作用,且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較好,初步完善了非昔羅霉素的抗菌譜。本研究驗(yàn)證了非昔羅霉素的生物合成基因簇中的部分基因并初步驗(yàn)證了磺�；D(zhuǎn)移酶在重要官能團(tuán)氮雜環(huán)丙烷生物合成機(jī)制中的重要作用,為進(jìn)一步通過遺傳改造提高該抗生素的產(chǎn)量提供了理論依據(jù),同時(shí)為獲得具有臨床應(yīng)用前景的結(jié)構(gòu)類似物奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R914
【部分圖文】：

?數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后用２ｘＹＴ液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)孢子懸液到一定濃度備用，過濾器過濾??裝置如圖２－１。??：７得??Ｉ??！??圖２－１孢子過濾器??Ｆｉｇ．?２－１?Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ?ｄｅｖｉｃｅ?ｏｆ?ｓｐｏｒｅｓ??１：底部已挖空的玻璃試管（Ａ?ｔｕｂｅ?ｗｉｔｈ?ａ?ｐｏｌｅ?ａｔ?ｔｈｅ?ｂｏｔｔｏｍ）?；?２：脫脂棉（Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ?ｃｏｔｔｏｎ）?；?３：??玻璃試管（Ｔｅａｔ?ｇｌａｓｓ）??２．２．４．２重組大腸桿菌ＥＴＩ２５６７菌懸液的制備??（１）

（４．６ｘ２５０?ｍｍ?），再通過布魯克液質(zhì)連用（Ｑ－ＴＯＦ）進(jìn)行產(chǎn)物的質(zhì)譜分析。??２．２．１２非昔羅霉素的分離純化方法??參照?qǐng)D２－２的流程對(duì)發(fā)酵液中的非昔羅霉素進(jìn)行純化，保持ｐ｜｜?８－１０的堿性環(huán)境。??發(fā)酵液離心后經(jīng)過硅藻土過濾去除殘留的不溶性雜質(zhì)，得到的上淸通過硅酸鎂吸附柱??除去ｆｅｌｄａｍｙｃｉｎ；?Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ?ＸＡＤ－４大孔樹脂柱可以除去ｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ。采用陰離子交換柱時(shí)??洗脫液為０．５?ｍｏｌ／Ｌ－２．０?ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣＩ溶液洗脫具體純化流程如圖２－２。非昔羅霉??素對(duì)紫外光只有末端吸收，故初步純化的樣品選擇用Ａｇｉｌｅｎｔ?１２６０高效液相色譜（蒸??發(fā)光散射）檢測(cè)樣品中物質(zhì)成分，使用的分析柱為Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ?ＮＦｂ?（３?｜＿ｉｍ，１５０??ｍｍ）。流動(dòng)相：Ａ相是含有０．１％甲酸的水，Ｂ相是含有０．１％甲酸的乙腈，流速為??０．２?ｍＬ／ｍｉｎ。洗脫條件：０－２０?ｍｉｎ，?Ｂ?相從?８０％降至?４０％；?２卜３０?ｍｉｎ，?Ｂ?相?４０％；?３０－４０??ｍｉｎ，?Ｂ相從４〇％提高至８０％；?４０－５０?ｍｉｎ，?Ｂ相８０％。結(jié)合質(zhì)譜分析對(duì)應(yīng)時(shí)間物質(zhì)的??質(zhì)核比并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析判定純化樣品為非昔羅霉素。???＾????－Ｖ??ｆｉ繼額處理稱減心?????￣￣??、，播酸沒論過夜

卜Ｔ?＼??（?ｐＫＣ１１３９－Ｍ?１??Ｃ７??圖３－１重組載體的構(gòu)建??Ｆｉｇ．?３－１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＫＣＩ?１３９－Ｍ??ｐＫＣｌ?１３９－Ｍ：?ｐＫＣＩ?１３９－Ｍ?Ｋ?ｐＫＣ１１３９－Ｍ２??將上述己構(gòu)建好的重組載體經(jīng)￡ｃ＾ＲＩ和所ｎｄｌｌ丨雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，酶切后通過瓊??脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖３－２所示。通過電泳圖可以看出，重組載體經(jīng)過雙酶切后??產(chǎn)生的的大片段與經(jīng)過酶切線性化的質(zhì)粒ｐＫＣｌ?１３９大小一致，約為６．５?ｋｂ，�。辏�，段１ｊ??插入片段大小…致，約為２．８?ｋｂ。將雙酶切驗(yàn)證正確的重組載體送去測(cè)序公ｕ＇ｊ測(cè)汴，??將結(jié)果正確的重組載體命名為ｐＫＣ丨丨３９－ＭＩ，即為本實(shí)驗(yàn)耑要用十Ｍ源承組雙交換基??因阻斷的質(zhì)粒。??１?２?Ｍ??Ｂｆｌ－＊?６．０?ｋｂ??—＇?３．０??圖３－２?ｐＫＣｌ?１３９－ＭＩ重組載體的酶切分析??Ｆｉｇ．?３－２?Ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＫＣｌ?１３（）－Ｍ?Ｉ??Ｍ：?ｍａｋｅｒ?（Ｉ?ｋｂ）?；?Ｉ、２：?ｐＫＣｌ?
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