核受體Nur77,也稱為TR3或NGFI-B,是NR4A1編碼的立早基因產(chǎn)物,在細胞增殖、分化、代謝、凋亡以及自噬等生物學(xué)進程中發(fā)揮重要作用。臨床研究表明,Nur77在很多的癌癥組織中高表達,如胰腺癌,結(jié)腸癌,膀胱癌等,這也預(yù)示著Nur77可能的促增殖功能;同時,Nur77還能夠通過出核定位線粒體并引起細胞色素C釋放的機制誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。Nur77在腫瘤細胞中的特殊功能使其成為腫瘤藥物開發(fā)中一個潛在的靶點。mTOR屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員,在哺乳動物細胞中廣泛存在。研究表明,mTOR信號通路的過度激活與眾多癌癥進程密切相關(guān),如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等。本課題旨在篩選以Nur77為靶點的抗腫瘤先導(dǎo)化合物,并對其機制進行探究。首先,我們從大量化合物中篩選得到三種對胃癌細胞有很好的殺傷作用且結(jié)構(gòu)類似的吲哚類衍生物7n、7s、7w,生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)它們能夠抑制胃癌細胞增殖并促進胃癌細胞凋亡。接著,通過對化合物的抗腫瘤機制研究發(fā)現(xiàn),化合物7s一方面能夠誘導(dǎo)Nur77的表達,出核以及線粒體定位進而啟動細胞凋亡;另一方面,化合物7s還能夠抑制對細胞生存非常重要的mTOR信號通路的激活。有趣的是,本論文還發(fā)現(xiàn)化合物7s對mTOR信號通路的抑制作用依賴于核受體Nur77的表達。最后,我們通過體外純化Nur77的配體結(jié)合域(LBD)蛋白,并進行等溫?zé)崃康味?ITC)和熒光滴定實驗,證明化合物7s能夠與Nur77的LBD區(qū)結(jié)合。因此,本論文通過對吲哚雜環(huán)系列化合物的篩選,發(fā)現(xiàn)化合物7s能夠靶向Nur77發(fā)揮抗腫瘤作用。通過機制的初步探討,發(fā)現(xiàn)化合物7s一方面通過Nur77的出核和線粒體定位介導(dǎo)細胞凋亡,另一方面通過Nur77依賴的方式抑制與細胞生存相關(guān)的mTOR信號通路的激活。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R914
【部分圖文】：

圖４．?ｍＴＯＲ復(fù)合體結(jié)構(gòu)圖??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍＴＯＲ?ｃｏｍｐｌｅｘ．??ｍＴＯＲ有很多磷酸化位點，其中絲氨酸２４８１位是其自磷酸化位點，這一位??點的磷酸化能夠監(jiān)控ｍＴＯＲ特異性的催化活性［１Ｇ８］。此外，生長因子等還能夠引??起ｍＴＯＲ其它位點的磷酸化。眾多研宄表明，ｍＴＯＲ相應(yīng)位點的磷酸化能夠增??加ｍＴＯＲ的活性并且對于ｍＴＯＲＣｌ的功能有重要影響Ｌ＂２】。有趣的是，Ｃｏｐｐ??等人發(fā)現(xiàn)ｍＴＯＲ絲氨酸２４８１位的磷酸化可以作為完整ｍＴＯＲＣ２復(fù)合體的一個??生物標記，因為在ｍＴ０ＲＣ２中絲氨酸２４８１位是顯著磷酸化的，而ｍＴＯＲＣｌ中??絲氨酸２４４８位是顯著磷酸化的［１１３】。細胞中，ｍＴＯＲＣｌ和ｍＴ０ＲＣ２信號通路的??上下游存在顯著差異，發(fā)揮的功能也各不相同。本論文中所用的ｐ－ｍＴＯＲ抗體主??要檢測Ｓｅｒ２４４８。??５．?２?ｍＴＯＲ

Ｆｉｇｕｒｅ?６．?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌｓ．??Ａ．將一定數(shù)量的三種胃癌細胞鋪于９６孔細胞培養(yǎng)板中，密度合適后用含１％血清的培??養(yǎng)基加藥處理４８?ｈ，然后加入ＭＴＴ溶液，繼續(xù)培養(yǎng)處理４?ｈ后收樣，檢測。根據(jù)０Ｄ值變化??求出細胞生存率并用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５軟件作圖；Ｂ．在六孔板中鋪適量細胞（５００個／孔），??待細胞培養(yǎng)２４?ｈ后開始加藥處理，用含１０％血清的培養(yǎng)基加藥，加藥濃度均為２?ｎＭ，培養(yǎng)??基四天更換一次，繼續(xù)培養(yǎng)，直至克隆清晰可見，然后吸去培養(yǎng)基，固定并用結(jié)晶紫染色??１０?ｍｉｎ，洗凈后拍照。??２．２吲哚類衍生物７ｎ、７ｓ、７ｗ誘導(dǎo)胃癌細胞的凋亡??細胞內(nèi)的ＰＡＲＰ?（Ｐｏｌｙ?ＡＤＰ－Ｒｉｂｏｓｅ?Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）蛋白在早期闊亡的時候會產(chǎn)??生切割，因此可以作為細胞早期凋亡的標志。我們采用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ的方法，通??過檢測ＰＡＲＰ切割來確定化合物誘導(dǎo)細胞凋亡的情況。首先我們分別檢測了?７ｎ、??７ｓ、７ｗ三個化合物在ＳＧＣ－７９０１、ＨＧＣ－２７以及ＢＧＣ－８２３三種胃癌細胞中誘導(dǎo)凋??

Ｆｉｇｕｒｅ?８．?Ｃｏｍｐｏｕｎｄ?７ｓ?ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＧＣ－７９０１?ｃｅｌｌｓ．??Ａ．?ＳＧＣ－７９０１細胞鋪于六孔板中，密度合適后用無菌的白色槍頭劃痕拍照，然后用含１％??血清的培養(yǎng)基加藥，使其終濃度為５?＿，處理４８?ｈ后再拍照。Ｂ．統(tǒng)計圖。??３．?７ｎ、７ｓ和７ｗ誘導(dǎo)Ｎｕｒ７７的表達??首先，在ＳＧＣ－７９０１細胞系中，我們采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，檢測化合物對Ｎｕｒ７７??的ｍＲＮＡ水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物能夠顯著的上調(diào)Ｎｕｒ７７的ｍＲＮＡ水平??（圖９Ａ）。接著我們通過Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ的方法檢測了化合物對Ｎｕｒ７７蛋白表達的??影響。同樣在ＳＧＣ－７９０１細胞系中，分別５?ｐＭ用的７ｎ、７ｓ、７ｗ處理細胞０．５?ｈ、??ｌｈ、３?ｈ、５?ｈ、７?ｈ，然后用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ檢測Ｎｕｒ７７蛋白表達的變化。結(jié)果表明，??化合物７ｎ、７ｓ、７ｗ能夠誘導(dǎo)Ｎｕｒ７７的蛋白的表達，其中７ｓ的誘導(dǎo)作用最明顯。??并且在３－５?ｈ時，Ｎｕｒ７７的上調(diào)作用最明顯（圖９Ｂ）。接著我們又做了一個濃度??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王維嘉;王淵;吳喬;;核受體TR3/Nur77與腫瘤治療[J];中國細胞生物學(xué)學(xué)報;2015年05期

2 ;Induction of apoptosis by TPA and VP-16 is through translocation of TR3[J];World Journal of Gastroenterology;2002年03期

本文編號：2847801