核受體Nur77,也稱為TR3或NGFI-B,是NR4A1編碼的立早基因產(chǎn)物,在細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡以及自噬等生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。臨床研究表明,Nur77在很多的癌癥組織中高表達(dá),如胰腺癌,結(jié)腸癌,膀胱癌等,這也預(yù)示著Nur77可能的促增殖功能;同時(shí),Nur77還能夠通過出核定位線粒體并引起細(xì)胞色素C釋放的機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Nur77在腫瘤細(xì)胞中的特殊功能使其成為腫瘤藥物開發(fā)中一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。mTOR屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在。研究表明,mTOR信號(hào)通路的過度激活與眾多癌癥進(jìn)程密切相關(guān),如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等。本課題旨在篩選以Nur77為靶點(diǎn)的抗腫瘤先導(dǎo)化合物,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探究。首先,我們從大量化合物中篩選得到三種對(duì)胃癌細(xì)胞有很好的殺傷作用且結(jié)構(gòu)類似的吲哚類衍生物7n、7s、7w,生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)它們能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。接著,通過對(duì)化合物的抗腫瘤機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),化合物7s一方面能夠誘導(dǎo)Nur77的表達(dá),出核以及線粒體定位進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡;另一方面,化合物7s還能夠抑制對(duì)細(xì)胞生存非常重要的mTOR信號(hào)通路的激活。有趣的是,本論文還發(fā)現(xiàn)化合物7s對(duì)mTOR信號(hào)通路的抑制作用依賴于核受體Nur77的表達(dá)。最后,我們通過體外純化Nur77的配體結(jié)合域(LBD)蛋白,并進(jìn)行等溫?zé)崃康味?ITC)和熒光滴定實(shí)驗(yàn),證明化合物7s能夠與Nur77的LBD區(qū)結(jié)合。因此,本論文通過對(duì)吲哚雜環(huán)系列化合物的篩選,發(fā)現(xiàn)化合物7s能夠靶向Nur77發(fā)揮抗腫瘤作用。通過機(jī)制的初步探討,發(fā)現(xiàn)化合物7s一方面通過Nur77的出核和線粒體定位介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,另一方面通過Nur77依賴的方式抑制與細(xì)胞生存相關(guān)的mTOR信號(hào)通路的激活。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R914
【部分圖文】：

圖４．?ｍＴＯＲ復(fù)合體結(jié)構(gòu)圖??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍＴＯＲ?ｃｏｍｐｌｅｘ．??ｍＴＯＲ有很多磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸２４８１位是其自磷酸化位點(diǎn)，這一位??點(diǎn)的磷酸化能夠監(jiān)控ｍＴＯＲ特異性的催化活性［１Ｇ８］。此外，生長因子等還能夠引??起ｍＴＯＲ其它位點(diǎn)的磷酸化。眾多研宄表明，ｍＴＯＲ相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化能夠增??加ｍＴＯＲ的活性并且對(duì)于ｍＴＯＲＣｌ的功能有重要影響Ｌ＂２】。有趣的是，Ｃｏｐｐ??等人發(fā)現(xiàn)ｍＴＯＲ絲氨酸２４８１位的磷酸化可以作為完整ｍＴＯＲＣ２復(fù)合體的一個(gè)??生物標(biāo)記，因?yàn)樵冢恚裕埃遥茫仓薪z氨酸２４８１位是顯著磷酸化的，而ｍＴＯＲＣｌ中??絲氨酸２４４８位是顯著磷酸化的［１１３】。細(xì)胞中，ｍＴＯＲＣｌ和ｍＴ０ＲＣ２信號(hào)通路的??上下游存在顯著差異，發(fā)揮的功能也各不相同。本論文中所用的ｐ－ｍＴＯＲ抗體主??要檢測Ｓｅｒ２４４８。??５．?２?ｍＴＯＲ

Ｆｉｇｕｒｅ?６．?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｇａｓｔｒｉｃ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌｓ．??Ａ．將一定數(shù)量的三種胃癌細(xì)胞鋪于９６孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度合適后用含１％血清的培??養(yǎng)基加藥處理４８?ｈ，然后加入ＭＴＴ溶液，繼續(xù)培養(yǎng)處理４?ｈ后收樣，檢測。根據(jù)０Ｄ值變化??求出細(xì)胞生存率并用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５軟件作圖；Ｂ．在六孔板中鋪適量細(xì)胞（５００個(gè)／孔），??待細(xì)胞培養(yǎng)２４?ｈ后開始加藥處理，用含１０％血清的培養(yǎng)基加藥，加藥濃度均為２?ｎＭ，培養(yǎng)??基四天更換一次，繼續(xù)培養(yǎng)，直至克隆清晰可見，然后吸去培養(yǎng)基，固定并用結(jié)晶紫染色??１０?ｍｉｎ，洗凈后拍照。??２．２吲哚類衍生物７ｎ、７ｓ、７ｗ誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡??細(xì)胞內(nèi)的ＰＡＲＰ?（Ｐｏｌｙ?ＡＤＰ－Ｒｉｂｏｓｅ?Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）蛋白在早期闊亡的時(shí)候會(huì)產(chǎn)??生切割，因此可以作為細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志。我們采用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ的方法，通??過檢測ＰＡＲＰ切割來確定化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。首先我們分別檢測了?７ｎ、??７ｓ、７ｗ三個(gè)化合物在ＳＧＣ－７９０１、ＨＧＣ－２７以及ＢＧＣ－８２３三種胃癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋??

Ｆｉｇｕｒｅ?８．?Ｃｏｍｐｏｕｎｄ?７ｓ?ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＧＣ－７９０１?ｃｅｌｌｓ．??Ａ．?ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞鋪于六孔板中，密度合適后用無菌的白色槍頭劃痕拍照，然后用含１％??血清的培養(yǎng)基加藥，使其終濃度為５?＿，處理４８?ｈ后再拍照。Ｂ．統(tǒng)計(jì)圖。??３．?７ｎ、７ｓ和７ｗ誘導(dǎo)Ｎｕｒ７７的表達(dá)??首先，在ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞系中，我們采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，檢測化合物對(duì)Ｎｕｒ７７??的ｍＲＮＡ水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物能夠顯著的上調(diào)Ｎｕｒ７７的ｍＲＮＡ水平??（圖９Ａ）。接著我們通過Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ的方法檢測了化合物對(duì)Ｎｕｒ７７蛋白表達(dá)的??影響。同樣在ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞系中，分別５?ｐＭ用的７ｎ、７ｓ、７ｗ處理細(xì)胞０．５?ｈ、??ｌｈ、３?ｈ、５?ｈ、７?ｈ，然后用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ檢測Ｎｕｒ７７蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果表明，??化合物７ｎ、７ｓ、７ｗ能夠誘導(dǎo)Ｎｕｒ７７的蛋白的表達(dá)，其中７ｓ的誘導(dǎo)作用最明顯。??并且在３－５?ｈ時(shí)，Ｎｕｒ７７的上調(diào)作用最明顯（圖９Ｂ）。接著我們又做了一個(gè)濃度??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王維嘉;王淵;吳喬;;核受體TR3/Nur77與腫瘤治療[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2015年05期

2 ;Induction of apoptosis by TPA and VP-16 is through translocation of TR3[J];World Journal of Gastroenterology;2002年03期

本文編號(hào)：2847801