促進(jìn)胰島祖細(xì)胞分化為新的β細(xì)胞,有望從根本上解決胰島β細(xì)胞損傷和數(shù)量減少的問題。因此,尋找新的分化誘導(dǎo)劑促進(jìn)胰島再生,對(duì)于有效緩解和治療糖尿病具有重要意義。胰腺十二指腸同源框-1(PDX-1)在胰島形成、自細(xì)胞分化及功能維持中具有至關(guān)重要的作用。本課題以PDX-1為目的基因構(gòu)建高通量篩選模型,篩選出了能促進(jìn)PDX-1表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)胰島祖細(xì)胞分化為胰島素分泌型細(xì)胞的化合物。首先,體外誘導(dǎo)PANC-1分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán),該細(xì)胞團(tuán)能表達(dá)胰島特異基因,且葡萄糖刺激后能分泌胰島素,移植到I型糖尿病小鼠腎包膜后,小鼠血糖可恢復(fù)到正常水平。表明,我們建立了將胰島樣祖細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞的方法。其次,運(yùn)用蛋白免疫印跡法(WB)和免疫熒光法研究了 PDX-1在PANC-1細(xì)胞分化不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)和分布。發(fā)現(xiàn)PDX-1主要在PANC-1細(xì)胞分化初期高表達(dá)并入核;而過表達(dá)PDX-1,可促進(jìn)PANC-1分化及成熟。表明,PDX-1對(duì)PANC-1細(xì)胞分化具有重要作用。再次,以PDX-1為目的基因構(gòu)建高通量篩選模型,篩選出能促進(jìn)PDX-1表達(dá)的植物粗提物C754。運(yùn)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜法鑒定出C754中的主要組分為C1037,即穿心蓮內(nèi)酯。qPCR和WB研究C1037的活性,發(fā)現(xiàn)C1037可濃度依賴性上調(diào)PDX-1表達(dá)。最后,C1037作用于PANC-1細(xì)胞后,檢測(cè)分化不同時(shí)間點(diǎn)胰島特異基因的表達(dá),以及胰島樣細(xì)胞團(tuán)對(duì)葡萄糖刺激的胰島素分泌。結(jié)果顯示,C1037能加速PANC-1細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ILCCs),并促進(jìn)ILCCs對(duì)葡萄糖刺激的胰島素分泌。說(shuō)明C1037能加速PANC-1細(xì)胞分化過程,為臨床治療糖尿病提供了新的候選分化誘導(dǎo)劑。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

出生后不久，內(nèi)分泌胰腺通過涉及大量細(xì)胞凋亡和細(xì)胞復(fù)制的過程進(jìn)行重構(gòu)。??在成人中，正常情況下細(xì)胞的轉(zhuǎn)換率較低，借助（至少在嚙齒類動(dòng)物中）細(xì)胞死??亡（通過細(xì)胞凋亡）與現(xiàn)有細(xì)胞的復(fù)制維持平衡（如圖１．３），這一結(jié)論通過使用??胰島素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Ｃｒｅ重組酶［１１８］的體內(nèi)譜系示蹤技術(shù)和基于ＤＮＡ類似物的??譜系示蹤技術(shù)［１１９］得到證實(shí)。??然而，Ｐ細(xì)胞總體數(shù)量可以通過調(diào)節(jié)以補(bǔ)償隨著年齡和妊娠而增加的代謝需??求，以及對(duì)抗與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗反應(yīng)。Ｐ細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的調(diào)節(jié)主要通過??經(jīng)ＩＲＳ－２調(diào)控的胰島素／ＩＧＦ信號(hào)傳導(dǎo)。因此，自細(xì)胞中ＩＲＳ－２基因失活的小鼠由??于細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞凋亡增加而導(dǎo)致３細(xì)胞衰竭。鑒于ＰＤＸ－１在胰腺發(fā)育，??細(xì)胞分化以及在成熟０細(xì)胞中基因表達(dá)的重要性，其被認(rèn)為是維持成人充足的健??康０細(xì)胞池的主要參與者。在Ｐｄｘｌ減少５０％的小鼠中，分離的胰島在基礎(chǔ)葡萄??糖濃度下更易于凋亡，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，其維持Ｐ細(xì)胞數(shù)量的能力下降。??Ｐｄｘｌ的功能可能由胰島素／ＩＧＦ信號(hào)途徑通過叉頭轉(zhuǎn)錄因子Ｆｏｘｏｌ調(diào)節(jié)。??１２??

為了研究胰島樣細(xì)胞團(tuán)是否能在體內(nèi)發(fā)揮生理活性，我們?cè)谀Ｐ托∈竽I包膜??下移植正常胰島細(xì)胞（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ）或分化后的胰島細(xì)胞團(tuán)，定時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠??血糖水平。如圖２．２?Ｂ所示，空白對(duì)照組小鼠血糖一直穩(wěn)定在８ｍＭ左右；假手??術(shù)組小鼠血糖在手術(shù)后無(wú)明顯變化，證明手術(shù)過程并不會(huì)對(duì)小鼠血糖值造成影響；??陽(yáng)性對(duì)照組，即移植正常胰島細(xì)胞，小鼠血糖顯著下降，恢復(fù)正常水平，證明胰??島細(xì)胞經(jīng)腎包膜移植入小鼠體內(nèi)后仍能存活且能正常發(fā)揮生理活性；實(shí)驗(yàn)組，即??移植分化后的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，小鼠血糖也顯著降低，恢復(fù)到正常血糖水平。??移植５天后，將陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠頸椎脫臼處死，取出移植后的腎組??織，經(jīng)石蠟包埋，切片后進(jìn)行ＨＥ染色和免疫熒光染色，觀察移植入小鼠腎包膜??下的胰島樣細(xì)胞團(tuán)的狀態(tài)。如圖２．２Ｃ所示，移植后的胰島樣細(xì)胞團(tuán)均勻分散在??腎組織上

根據(jù)熒光值大小計(jì)算各粗提物的增強(qiáng)率。如圖４．１?Ｂ所示，橫坐標(biāo)??代表不同植物粗提物，縱坐標(biāo)代表增強(qiáng)率，增強(qiáng)率大于零代表粗提物增強(qiáng)ＰＤＸ－??１啟動(dòng)子活性，小于零代表粗提物抑制ＰＤＸ－１啟動(dòng)子活性。??我們選取增強(qiáng)率較大，離散值較高的１１個(gè)粗提物，ＰＣＲ初步檢測(cè)其對(duì)ＰＤＸ－??ｌｍＲＮＡ水平是否具有增強(qiáng)效應(yīng)。如圖４．１?Ｃ所示，粗提物刺激２４ｈ后，提取細(xì)??胞總ＲＮＡ檢測(cè)ＰＤＸ－１的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７相較于??對(duì)照組對(duì)ＰＤＸ－１的表達(dá)有些微增強(qiáng)作用。??為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７的活性，我們用ｗｅｓｔｅｒｎ??ｂｌｏｔｔｉｎｇ?檢測(cè)了?Ｃ４２１、Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７?對(duì)于?ＰＤＸ－１?蛋白水平上的調(diào)節(jié)??作用。如圖４．１?Ｄ所示，Ｃ５８２、Ｃ７１３、Ｃ７５４、Ｃ８０７均能明顯促進(jìn)ＰＤＸ－１的表達(dá)，??說(shuō)明我們構(gòu)建的高通量篩選模型不僅能實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)化合物進(jìn)行篩選，且篩選??結(jié)果具有參考性。由于Ｃ７５４上調(diào)ＰＤＸ－１表達(dá)的能力最強(qiáng)，固我們選�。茫罚担醋�??為候選化合物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。??Ａ?Ｓｒ＇ｔｈｃｔｉ：?ｐｏｉｙｔＡ?Ｂ??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Reversal of hyperglycemia in diabetic rats by portal vein transplantation of islet-like cells generated from bone marrow mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2007年24期

2 ;Nestin-positive progenitor cells isolated from human fetal pancreas have phenotypic markers identical to mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2005年19期

本文編號(hào)：2847699