目的:制備并探討肝素酶(Heparanase,Hpa)納米疫苗對(duì)腫瘤的殺傷效果。方法:1.在體外合成肝素酶單肽(Hpa)、4分支肽(MAP)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米顆粒,用PLGA包埋這兩種肝素酶抗原肽,構(gòu)建PLGA包埋的肝素酶納米疫苗。2.用密度梯度離心法從健康人外周血中提取人單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),并將其分為單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。用細(xì)胞因子GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(20ng/ml)和TNF-α(20ng/ml)將單核細(xì)胞誘導(dǎo)成為樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs),用于吞噬、提呈抗原;淋巴細(xì)胞用納米疫苗及IL-2刺激成為效應(yīng)細(xì)胞,即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL),用于殺傷靶細(xì)胞。3.體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株SGC-7901(Hpa+,HLA-A2-)、KATO-III(Hpa+,HLA-A2+),乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(Hpa-,HLA-A2+)、BT-549(Hpa+,HLA-A2+),自身淋巴細(xì)胞和DC作為靶細(xì)胞,用蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測(cè)四種腫瘤細(xì)胞中肝素酶的含量。4.為研究該納米疫苗是否能成功刺激淋巴細(xì)胞成為CTL,將納米疫苗與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),期間加入IL-2促進(jìn)T細(xì)胞活化,共刺激結(jié)束后用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)釋放量。5.為研究該納米疫苗誘導(dǎo)的CTL對(duì)肝素酶及HLA-A2雙陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞是否具有廣泛性,以CTL為效應(yīng)細(xì)胞、KATO-III和BT-549為靶細(xì)胞共培養(yǎng)后,用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測(cè)CTL對(duì)上述兩種靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。6.為研究該納米疫苗誘導(dǎo)的CTL是否具有Hpa特異性,以CTL為效應(yīng)細(xì)胞、MCF-7為靶細(xì)胞共培養(yǎng)后,用LDH釋放法檢測(cè)CTL對(duì)該靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。7.為研究該納米疫苗誘導(dǎo)的CTL是否具有HLA-A2特異性,以CTL為效應(yīng)細(xì)胞、SGC-7901為靶細(xì)胞共培養(yǎng)后,用LDH釋放法檢測(cè)CTL對(duì)該靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。8.為研究該納米疫苗的安全性,以CTL為效應(yīng)細(xì)胞、自身DC和淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞共培養(yǎng)后,用LDH釋放法檢測(cè)CTL對(duì)這兩種靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。9.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以?x±s表示,采用SPSS 19分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.成功合成肝素酶單肽Hpa(KMLKSFLKA)和該單肽合成的4分支肽,其純度分別為97.91%和84.37%。2.成功合成直徑為105.5nm的PLGA納米顆粒,用其包埋Hpa和MAP,包埋后的粒徑分別為111.3nm和121.2nm。3.用western blot檢測(cè)4種腫瘤細(xì)胞中肝素酶的含量,結(jié)果顯示為SGC-7901、KATO-III和BT-549細(xì)胞中肝素酶為陽(yáng)性,而MCF-7細(xì)胞中肝素酶為陰性。4.成功從外周血分離出單核細(xì)胞,并用其誘導(dǎo)為成熟DC,采用流式細(xì)胞術(shù)分析DC表型結(jié)果顯示,CD1α、CD80、CD83和HLA-A2均符合成熟DC表型,其陽(yáng)性率分別為85.4%、88.7%、90.1%和93.2%。5.我們采用ELISA法檢測(cè)不同的納米疫苗誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞分泌FN-γ量結(jié)果顯示,PLGA納米疫苗包埋的MAP疫苗(PLGA-MAP)及PLGA-Hpa納米疫苗產(chǎn)生的FN-γ量明顯高于MAP組、Hpa組、PLGA組和空白對(duì)照組。6.效應(yīng)細(xì)胞對(duì)肝素酶和HLA-A2雙陽(yáng)性的KATO-III和BT-549腫瘤細(xì)胞均有顯著的殺傷效應(yīng);對(duì)肝素酶陰性而HLA-A2陽(yáng)性的MCF-7和肝素酶陽(yáng)性而HLA-A2陰性的SGC-7901細(xì)胞沒有殺傷效應(yīng)。7.效應(yīng)細(xì)胞對(duì)子自身的淋巴細(xì)胞和DC均沒有殺傷效應(yīng)。結(jié)論:1.成功制備100nm左右的PLGA-MAP肝素酶納米疫苗。2.PLGA-MAP納米疫苗可以刺激效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。3.PLGA-MAP納米疫苗誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤具有良好的殺傷效應(yīng),其具有肝素酶特異性并且受HLA-A2限制。4.PLGA-MAP納米疫苗誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)自身淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞無殺傷效應(yīng),其安全性良好。5.PLGA-MAP納米疫苗對(duì)HLA-A2和Hpa雙陽(yáng)性的KATO-III胃癌細(xì)胞和BT-549乳腺癌細(xì)胞均具有殺傷效應(yīng),其具有廣泛抗腫瘤的特點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料與方法
結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
英漢縮略詞對(duì)照表
致謝
Application of multifunctional nanomaterials in cancer vaccines(綜述)
    References

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