發(fā)布時間：2020-10-16 23:31

　　 目的:考察不同濃度葡萄糖對H9c2心肌細胞增殖活性和氧化應(yīng)激的影響,構(gòu)建體外高糖微環(huán)境。研究羅格列酮(RSG)對高糖微環(huán)境下H9c2細胞氧化應(yīng)激、能量代謝和細胞凋亡的影響。方法:(1)構(gòu)建體外高糖微環(huán)境:將含有不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基處理的心肌細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h,利用倒置顯微鏡觀察心肌細胞形態(tài)學變化,噻唑藍(MTT)法檢測心肌細胞活性,酶標法檢測還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量,四唑鹽(WST-1)法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力,流式細胞法檢測活性氧(ROS)水平,酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)。(2)篩選RSG濃度及時間:采用MTT法測定不同濃度RSG作用24 h、48 h和72 h對高糖微環(huán)境下H9c2心肌細胞活性的影響,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,確定RSG體外心肌實驗的低、中、高濃度及最佳作用時間。(3)RSG對細胞的影響:RSG低、中、高濃度作用高糖微環(huán)境下H9c2心肌細胞48 h后,檢測GSH、MDA含量和SOD活力,流式細胞法檢測ROS水平,Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡率,羅丹明123(Rh-123)檢測心肌細胞線粒體膜電位(MMP),反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測心肌細胞中ATP、ADP和AMP含量。結(jié)果:(1)33.30 mmol·L~(-1)葡萄糖組作用心肌細胞24 h后,與正常葡萄糖組(25 mmol·L~(-1))比較,細胞活性、SOD活性和GSH含量均明顯降低(P0.05),而ROS水平明顯升高(P0.05),MDA含量升高,炎癥因子TNF-a、TGF-β1的濃度均顯著增加(P0.05)。33.30 mmol·L~(-1)葡萄糖、24 h是抑制細胞增殖形成氧化應(yīng)激的濃度和時間折點。(2)MTT實驗結(jié)果,RSG處理心肌細胞48 h能獲得良好的抑制規(guī)律曲線(R~2=0.9861,IC_(50)為456.31μmol·L~(-1)),因此確定48 h為處理時間。篩選得到RSG作用48 h的低、中、高濃度分別為340.00μmol·L~(-1)、450.00μmol·L~(-1)和560.00μmol·L~(-1)。與對照組(5.56 mmol·L~(-1))比較,RSG使細胞GSH含量減少、SOD活力降低,MDA含量增加,ROS水平升高;MMP和線粒體內(nèi)5’-三磷酸腺苷(ATP)含量顯著降低,5’-二磷酸腺苷(ADP)和5’-磷酸腺苷(AMP)含量顯著升高,心肌細胞凋亡率明顯增加,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)ATP、ADP和AMP的RP-HPLC分析方法:Agilent ZORB-AX SB-C_(18)柱(4.6mm×150 mm,5μm),流動相為0.2 mol·L~(-1)磷酸鹽緩沖液(含0.805 g四丁基溴化銨)∶甲醇=95∶5,柱溫35°C,流速1 mL·min~(-1),紫外檢測波長258 nm。ATP、ADP和AMP的保留時間分別為11.8 min、7.5 min和4.3 min。ATP、ADP和AMP分別在0.75~48μg·mL~(-1)、0.50~32.00μg·mL~(-1)、0.25~16.00μg·mL~(-1)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。ATP、ADP和AMP的最低定量限(LLOQ)分別為0.75μg·mL~(-1)、0.50μg·mL~(-1)和0.25μg·mL~(-1)(S/N=10);平均提取回收率在65.28%~81.08%范圍內(nèi),日內(nèi)相對標準偏差(RSD)、日間RSD和穩(wěn)定性RSD均15%。結(jié)論:(1)高糖微環(huán)境是抑制心肌細胞增殖,誘導細胞氧化應(yīng)激的重要因素。33.30 mmol·L~(-1)葡萄糖作用H9c2心肌細胞24 h是構(gòu)建體外高糖微環(huán)境的最佳濃度與時間。(2)研究建立了能同時測定ATP、ADP和AMP含量的RP-HPLC分析方法,精密度、準確度符合要求且穩(wěn)定性良好。(3)RSG濃度大于340.00μmol·L~(-1)可能通過影響心肌細胞氧化應(yīng)激、能量代謝,誘導細胞凋亡產(chǎn)生心肌損害作用。
【學位單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

圖 1-2 正常培養(yǎng)的 H9c2 細胞Fig.1-2 The H9c2 cells of normal culture的復蘇：①37 C 水浴預熱培養(yǎng)基；②從液氮 5 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基（添加 10% 胎牛血重懸細胞，離心 5 min（1000 rpm）；④棄上后轉(zhuǎn)入 T25培養(yǎng)瓶中；⑤置于 37 C、5% CO胞的傳代：①當細胞貼壁生長匯合至≥80%覆 3 遍，胰酶消化；②觀察到細胞變圓，有細輕輕吹散細胞，離心 5 min（1000 rpm）；④ 1:3 的比例傳代；⑤于細胞培養(yǎng)箱中孵育 24胞的凍存：①取對數(shù)生長期的細胞，棄培養(yǎng)；②觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁

圖 1-3 二極管陣列檢測器檢測能量物質(zhì) 3D 掃描圖Fig.1-3 The 3D chart of energy substances by diode array detector 溶液的配制備液的配制別精密稱取 ATP、ADP 和 AMP 對照品 20.0 mg、10.0 mg 和 10.0 mg溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，分別得濃度為2.0 mg·mL-1、1.0 mg·mg·mL-1的 ATP、ADP 和 AMP 對照品儲備液，再稀釋成不同濃度的。作液的配制標準曲線工作液的配制：以超純水為溶劑，按表 1-4，表 1-5，表 1-6 DP和AMP標準曲線工作液（Working solution preparation of standard cS1~WS7，將配制好的標準曲線工作液 4 C 避光保存。

細胞邊緣界限清楚；培養(yǎng) 48 h細胞（圖 2-1，A-2）伸出偽足交織成網(wǎng)，融合度增高；繼續(xù)培養(yǎng)至 72 h 細胞（圖2-1，A-3）基本融合，形態(tài)變?yōu)閳A形或橢圓形。2.1.1.2 低濃度葡萄糖組心肌細胞形態(tài)低濃度葡萄糖組（5.56 mmol·L-1）培養(yǎng)心肌細胞 24 h（圖 2-1，B-1），細胞大小不規(guī)則，細胞間隙較寬；繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h（圖 2-1，B-2），部分細胞變圓，細胞邊緣開始模糊；培養(yǎng)至 72 h（圖 2-1，B-3）
【參考文獻】

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本文編號：2843931