癌癥作為世界上最致命的疾病之一,仍然是威脅人類健康的嚴(yán)重問題。目前腫瘤的治療方法主要是手術(shù)治療、放射治療和藥物治療,藥物治療仍舊發(fā)揮著相當(dāng)大作用。但是腫瘤患者在使用藥物時(shí)往往由于化療單一用藥容易導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生,治療作用大大降低。聯(lián)合治療正在逐漸變成治療癌癥的一種有效的新手段。光動(dòng)力治療(PDT)起源于1900年德國(guó)Raab首次發(fā)現(xiàn)光和光敏劑的結(jié)合能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng),后來經(jīng)過數(shù)十年發(fā)展,PDT成為治療非小細(xì)胞肺癌和食管癌非常有效的治療手段。為了減少耐藥性的產(chǎn)生,多種化療藥物聯(lián)合或化療藥物與光敏劑共遞送以抑制不同代謝途徑從而增加對(duì)癌細(xì)胞的殺滅作用。然而,化療藥物的快速清除和非特異性分布嚴(yán)重降低化療的有效性,不可避免地造成全身毒性。光敏劑也存在著低水溶性和靶向性以及穩(wěn)定性差的問題。為了最大限度地提高聯(lián)合治療效果,并減少其對(duì)正常組織的毒性,將藥物共價(jià)接枝到大分子聚合物上形成聚合物-藥物結(jié)合物是一種很有前景的研究方向。通過對(duì)以前工作的調(diào)研,我們選擇了紫杉醇類抗腫瘤藥物多西他賽(docetaxel,DTX)、蒽環(huán)類抗腫瘤藥多柔比星(doxorubicin,DOX)和第二代光敏劑二氫卟吩e6(chlorin e6,Ce6)作為模型藥物,形成腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性聚合物-藥物結(jié)合物用于聯(lián)合抗腫瘤研究。研究包含兩方面內(nèi)容:(1)以對(duì)腫瘤還原微環(huán)境響應(yīng)的二硫鍵作橋梁,將兩種不同的化療藥物分別共價(jià)結(jié)合到兩親性嵌段共聚物上,在水中自組裝形成混合膠束,實(shí)現(xiàn)化療聯(lián)合用藥;(2)引入腫瘤pH響應(yīng)的腙鍵,將化療藥物與光敏劑共同接枝到具有靶向性的生物相容性良好的聚合物上形成納米粒,實(shí)現(xiàn)化療與光動(dòng)治療聯(lián)合應(yīng)用。具體研究?jī)?nèi)容與方法如下:1.腫瘤還原微環(huán)境響應(yīng)性聚合物-藥物混合膠束用于聯(lián)合用藥抗腫瘤研究DTX是一種高效抗腫瘤藥物,經(jīng)FDA批準(zhǔn),可以用于多種腫瘤的治療。DTX水溶性較差,臨床上多利用吐溫-80增溶,而吐溫-80在I期臨床試驗(yàn)中會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的超敏反應(yīng)和神經(jīng)毒性。此外DTX容易引起中性粒細(xì)胞減少癥等免疫系統(tǒng)的毒性,給患者的身心造成很大的損害,限制了它在臨床上的應(yīng)用。DOX是乳腺癌化療中最常用的藥物之一,其作用機(jī)理主要是DOX的糖苷配基嵌入DNA,抑制DNA、RNA的合成。DOX在臨床應(yīng)用時(shí)也存在著嚴(yán)重的骨髓抑制和心臟毒性等毒副作用。為了解決化療藥的難溶性和系統(tǒng)性毒性等問題,我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一種兩親性嵌段共聚物mPEG2k-PCL2k-SS-COOH,通過將兩種藥物DOX和DTX分別結(jié)合到共聚物上,形成mPEG2k-PCL2k-SS-DOX及mPEG2k-PCL2k-SS-DTX結(jié)合物。通過核磁共振氫譜(1H-NMR)及傅里葉紅外光譜(FT-IR)證明產(chǎn)物合成成功。采用透析法制備了混合膠束mPEG-PCL-SS-DOX/mPEG-PCL-SS-DTX(摩爾比=1:1);采用芘探針法測(cè)定混合膠束臨界膠束濃度(CMC),為1.8×10-4 mM;通過TEM觀察評(píng)價(jià)混合膠束呈現(xiàn)球形,形態(tài)分散性較好,DLS測(cè)定粒徑大小約223.7 nm;采用動(dòng)態(tài)膜透析法考察混合膠束的體外釋藥行為,結(jié)果證明該制劑緩釋效果明顯,且具有還原敏感性。溶血試驗(yàn)表明混合膠束生物相容性良好,體外細(xì)胞吸收和細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明,混合膠束能有效地積累在MCF-7細(xì)胞中,抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)的由聚合物-藥物自組裝形成的氧化還原敏感混合膠束可作為一種有前景的藥物共遞送系統(tǒng)用于癌癥治療。2.腫瘤pH響應(yīng)性聚合物-藥物納米粒用于化療-光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤研究Ce6已被FDA批準(zhǔn)可用于臨床光動(dòng)力診斷。其經(jīng)光照射后的單線態(tài)氧產(chǎn)率高,且具有對(duì)腫瘤殺傷力強(qiáng)、體內(nèi)清除速度快、毒副作用小等特點(diǎn)。然而,Ce6對(duì)腫瘤組織的特異性識(shí)別能力差,疏水性較強(qiáng)影響其在生理介質(zhì)中的分散性,造成團(tuán)聚,降低ROS的產(chǎn)率,限制其在臨床上的應(yīng)用。透明質(zhì)酸是一種線性大分子黏多糖,具有良好的生物相容性和親水性,它可以與腫瘤細(xì)胞表面過量表達(dá)的CD44受體結(jié)合增強(qiáng)制劑的入胞能力。我們以其為載體材料構(gòu)建腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng),引入pH敏感鍵,將DOX與Ce6共同接枝到HA上形成HA-DOX-Ce6(HDC)結(jié)合物,1H-NMR和FT-IR表明結(jié)合物合成成功,通過直接溶解法制備了 HDC納米粒,TEM和DLS結(jié)果顯示HDC納米粒具有良好的球形結(jié)構(gòu),分散性較好,粒徑為152.8 nm。體外釋放實(shí)驗(yàn)說明HDC納米粒具有pH敏感釋藥的特性。體外光動(dòng)實(shí)驗(yàn)表明與Ce6原料藥相比,HDC納米粒具有更強(qiáng)的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力,細(xì)胞內(nèi)的ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中HDC納米粒在激光照射下的熒光最強(qiáng)再一次證實(shí)了此結(jié)論。HDC納米粒由于具有靶向性,入胞能力得到顯著提高,體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)和體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)表明由于HDC納米粒將化療與光動(dòng)治療聯(lián)合應(yīng)用,具有最強(qiáng)的腫瘤殺傷能力。體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)向我們展示了HDC納米粒有較好的靶向能力和熒光成像能力。我們合成的HDC納米粒具有pH響應(yīng)、靶向遞送、近紅外熒光成像和化療-光動(dòng)聯(lián)合治療能力,為多功能的化療-光動(dòng)聯(lián)合治療的研究提供更多的可能性。綜上所述,我們對(duì)腫瘤微環(huán)境智能響應(yīng)性聚合物-藥物結(jié)合物用于聯(lián)合抗腫瘤進(jìn)行了詳細(xì)研究,結(jié)果顯示化療藥聯(lián)合治療和化療-光動(dòng)聯(lián)合治療均能起到有效的抗腫瘤作用,通過形成聚合物-藥物混合膠束和聚合物-藥物納米粒,提高了疏水性藥物的溶解,減少了系統(tǒng)性毒性,利用EPR效應(yīng)和主動(dòng)靶向能力增強(qiáng)治療效果,為聚合物-藥物結(jié)合物在生物領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更多的可能性。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

它們除了殺死腫瘤細(xì)胞外，還會(huì)殺死正常細(xì)胞，造成全身毒性�；熕幍乃�??性差和腎清除速度快也讓其在臨床應(yīng)用中受到限制。針對(duì)以上問題，我們?cè)O(shè)計(jì)??了一個(gè)還原敏感混合膠束體系，如圖１－２所示，由兩親性聚合物前藥自組裝形??１４??

２．２．２建立標(biāo)準(zhǔn)曲線??以ＤＴＸ吸光度Ｊ為縱坐標(biāo)，濃度ｃ／〇ｉｇ?ｍｌ／１）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如表??２－１、圖２－７所示，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是Ｊ＝０．０１９６?ｃ＋０．００９６，７？２＝０．９９９３，表明??標(biāo)準(zhǔn)曲線在范圍１０．０－４０．０?ｐｇｍＬ—１內(nèi)線性良好。??表２－１?ＤＴＸ的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果??Ｔａｂｌｅ?２－１?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＤＴＸ?（實(shí)驗(yàn)記錄本??０００３３５７－ｐ７）??ｃ／〇ｇ?ｍＵ１）?１０．００?１５．００?２０．００?３０．００?４０．００??Ａ?０．２０４?０．３１３?０．３９４?０．５９９?０．７９６??０．８??ｏ?Ｚ??｜??｜°－４??０．２／＾??１０?２０?３０?４０??Ｃ?（ｐｇ?ｍＬ－１）??圖２－７?ＤＴＸ的標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆｉｇ．?２－７?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ＤＴＸ?（實(shí)驗(yàn)記錄本?０００３３５７－ｐ７）??２．２．３日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)??如表２－２所示，ＤＴＸ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液低、中、高三種濃度的日內(nèi)、日間精密度??ＲＳＤ值均＜２％，精密度良好，符合測(cè)定要求。??表２－２?ＤＴＸ的日內(nèi)、日間精密度結(jié)果??Ｔａｂｌｅ?２－２?Ｔｈｅ?ｉｎｔｒａｄａｙ?ａｎｄ?ｉｎｔｅｒｄａｙ?ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＤＴＸ?（實(shí)驗(yàn)記錄本?０００３３５７－??ｐ９）??ｃ／（ｎｇ?ｍＬ＂１）????Ａ?Ｍｅａｎ土ＳＤ?ＲＳＤ％?Ａ?Ｍｅａｎ士ＳＤ?ＲＳＤ％??３０??

２．３?ｍＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ２ｋ－ＳＳ－ＤＯＸ?中?ＤＯＸ?的含置測(cè)定??２．３．１檢測(cè)波長(zhǎng)的確定??紫外掃描的結(jié)果見圖２－８，當(dāng)ＤＯＸ．ＨＣ１和ｍＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ２ｋ－ＳＳ－ＤＯＸ在乙腈??溶液中，在４８０?ｎｍ處有最大吸收，ｍＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ２ｋ－ＳＳ－ＣＯＯＨ在此波長(zhǎng)處不存在??吸收，不干擾ＤＯＸ的測(cè)定，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為４８０?ｎｍ。??．?—ＤＯＸＨＣＩ??〇?１－２?＇?—ｍＰＥＧ－ＰＣＬ－ＳＳ－ＤＯＸ??〇?—ｍＰＥＧ－ＰＣＬ－ＳＳ－ＣＯＯＨ??Ｓ?０．８－??—??Ｉ?．?Ｉ?．?Ｉ?．?Ｉ?．??３６０?４８０?６００?７２０??入（ｎｍ）??圖?２－８?ＤＯＸ．ＨＣｌ，?ｍＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ２ｋ－ＳＳ－ＣＯ〇Ｈ?和?ｍＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ２ｋ－ＳＳ－ＤＯＸ?紫外??光譜??Ｆｉｇ．?２－８?Ｔｈｅ?ＵＶ?ｓｐｅｃｔｒａ?ｏｆ?ＤＯＸ．ＨＣｌ，ｍＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ２ｋ－ＳＳ－ＣＯＯＨ?ａｎｄ?ｍＰＥＧ２ｋ－??ＰＣＬ２ｋ－ＳＳ－ＤＯＸ?（實(shí)驗(yàn)記錄本?０００３３５７－ｐｌ?１）??２．３．２建立標(biāo)準(zhǔn)曲線??以ＤＯＸ．ＨＣ１吸光度ｊ為縱坐標(biāo)，濃度ｃ／〇ｉｇ?ｍＵ１）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線??如表２－４、圖２－９所示
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