在臨床治療中,多藥耐藥的產(chǎn)生是化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的最主要因素。腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生的分子機(jī)制相對(duì)復(fù)雜,其中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(ABC家族)在腫瘤組織中高表達(dá)被認(rèn)為是引起腫瘤多藥耐藥的主要原因。ABCB1(也稱(chēng)為P-glycoprotein)是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主要成員,已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織高表達(dá),如結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等。ABCB1可以識(shí)別多種抗腫瘤化療藥物,如紫杉醇、喜樹(shù)堿類(lèi)、蒽環(huán)霉素等,利用ATP水解釋放的能量,將其泵出腫瘤細(xì)胞外,使其在細(xì)胞內(nèi)的濃度下降,進(jìn)而導(dǎo)致化療藥物功效減弱甚至消失,最終產(chǎn)生多藥耐藥。將ABCB1抑制劑與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)用,降低ABCB1的表達(dá)或者活性,增加抗腫瘤藥物在耐藥細(xì)胞中的濃度,被認(rèn)為是臨床上克服ABCB1介導(dǎo)的多藥耐藥非常有前景的策略。目前為止,現(xiàn)有的ABCB1抑制劑由于選擇性差、藥物相互作用及安全性等問(wèn)題,限制了其臨床應(yīng)用,因此,發(fā)現(xiàn)一種高效低毒、選擇性強(qiáng)的新型ABCB1抑制劑一直是解決腫瘤耐藥問(wèn)題的研究熱點(diǎn)。本課題發(fā)現(xiàn)了三個(gè)系列的新型嘧啶類(lèi)耐藥逆轉(zhuǎn)劑,對(duì)于ABCB1介導(dǎo)的腫瘤耐藥性具有不同程度的耐藥逆轉(zhuǎn)活性,并對(duì)其耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制進(jìn)行研究。本課題的研究結(jié)果和主要發(fā)現(xiàn)包括:(1)含1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元的嘧啶類(lèi)衍生物對(duì)ABCB1介導(dǎo)的腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制研究(系列一)通過(guò)對(duì)課題組內(nèi)的小分子化合物庫(kù)中約500個(gè)化合物進(jìn)行初步篩選,發(fā)現(xiàn)含有1,2,3-三氮唑以及嘧啶結(jié)構(gòu)單元的小分子化合物,能夠不同程度地逆轉(zhuǎn)ABCB1高表達(dá)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株SW620/AD300對(duì)紫杉醇的耐藥性。同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道,含有嘧啶母核的酪氨酸激酶抑制劑(TKIs),如吉非替尼和厄洛替尼,也是ABCB1以及其他ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑;且1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元也普遍應(yīng)用在ABCB1抑制劑的設(shè)計(jì)合成中�；诤Y選發(fā)現(xiàn)和文獻(xiàn)支持,結(jié)合分子拼合原理,最終發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)含1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元的嘧啶類(lèi)新型耐藥逆轉(zhuǎn)劑(系列一)并對(duì)其耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果表明,系列一化合物對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株SW620/AD300具有不同程度的耐藥逆轉(zhuǎn)活性,其中化合物15,17,25,34,36的逆轉(zhuǎn)活性明顯優(yōu)于ABCB1抑制劑Verapamil。構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元的引入對(duì)化合物逆轉(zhuǎn)耐藥活性的提升起到了重要作用。其中逆轉(zhuǎn)活性最好的化合物25對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株SW620/AD300中ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位沒(méi)有影響,而是通過(guò)抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能,增加紫杉醇在耐藥細(xì)胞中的蓄積量,使其達(dá)到細(xì)胞毒有效濃度,發(fā)揮抗腫瘤作用。(2)含雙酰胺、1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元的嘧啶類(lèi)衍生物對(duì)ABCB1介導(dǎo)的腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制研究(系列二)在對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步優(yōu)化中,基于系列一的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),我們一方面保留了對(duì)ABCB1抑制活性影響明顯的官能團(tuán),如1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元、鹵素基團(tuán)、芳環(huán)基團(tuán)、正電子基團(tuán)等;另一方面引入具有潛在增強(qiáng)ABCB1抑制活性的芳環(huán)、雙酰胺結(jié)構(gòu)單元,最終篩選得到一類(lèi)含雙酰胺、1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元的嘧啶類(lèi)衍生物(系列二)。相對(duì)于系列一,系列二化合物的耐藥逆轉(zhuǎn)活性并沒(méi)有得到提高,反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。分子對(duì)接結(jié)果確認(rèn)了雙酰胺結(jié)構(gòu)單元的加入的確增加了化合物與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)。另有研究表明,化合物的脂溶性對(duì)其能否結(jié)合于ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的疏水性藥物結(jié)合口袋至關(guān)重要,因此我們對(duì)比了兩個(gè)系列中的四組化合物(系列一化合物34,35,36,38與系列二化合物10,11,12,13)的脂溶性,結(jié)果顯示,系列二化合物10,11,12,13的脂溶性降低。綜合以上結(jié)果,我們推測(cè)雖然雙酰胺結(jié)構(gòu)單元的加入增強(qiáng)了化合物與ABCB1的氫鍵相互作用,然而也導(dǎo)致化合物尺寸偏大,使部分官能團(tuán)暴露在溶劑區(qū),脂溶性下降,降低了與ABCB1蛋白的疏水性藥物結(jié)合口袋的結(jié)合強(qiáng)度,最終導(dǎo)致活性下降。這為我們進(jìn)一步優(yōu)化化合物結(jié)構(gòu),提升逆轉(zhuǎn)活性提供了方向。(3)含雙酰胺結(jié)構(gòu)單元的嘧啶類(lèi)衍生物對(duì)ABCB1介導(dǎo)的腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制研究(系列三)基于系列二的研究結(jié)果,我們?nèi)サ?,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)單元以縮短分子尺寸,篩選得到一類(lèi)含雙酰胺結(jié)構(gòu)單元的嘧啶類(lèi)衍生物(系列三),并且對(duì)其耐藥逆轉(zhuǎn)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明系列三化合物的耐藥逆轉(zhuǎn)活性整體上明顯優(yōu)于前兩個(gè)系列化合物,且系列三中化合物15,18,19,12對(duì)比于系列二中化合物27-29、34脂溶性也得到了提高,證實(shí)了脂溶性對(duì)提高化合物逆轉(zhuǎn)活性的重要性。我們選擇逆轉(zhuǎn)活性最好的化合物19做進(jìn)一步的機(jī)制研究。結(jié)果表明化合物19同樣不影響結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株SW620/AD300中ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位,而是通過(guò)抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能,增加紫杉醇在耐藥細(xì)胞中的蓄積量,使其達(dá)到細(xì)胞毒有效濃度,發(fā)揮抗腫瘤作用;通過(guò)ATPase活性實(shí)驗(yàn)推測(cè)化合物19是一個(gè)ABCB1底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,通過(guò)與紫杉醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于ABCB1的藥物結(jié)合口袋,增加紫杉醇的細(xì)胞內(nèi)濃度,從而逆轉(zhuǎn)耐藥;化合物19對(duì)CYP3A4(細(xì)胞色素P450 3A4)沒(méi)有明顯的抑制活性,表明該化合物可以做為一個(gè)安全有效的先導(dǎo)化合物;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明化合物19也能夠在體內(nèi)發(fā)揮耐藥逆轉(zhuǎn)活性,且毒副作用小,具有良好的應(yīng)用前景�？傊�,結(jié)合分子拼合原理,經(jīng)過(guò)多輪優(yōu)化篩選,最終發(fā)現(xiàn)了三個(gè)系列的新型嘧啶類(lèi)耐藥逆轉(zhuǎn)劑,能夠在不同程度上逆轉(zhuǎn)ABCB1高表達(dá)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株SW620/AD300對(duì)紫杉醇的耐藥性,極大地豐富了現(xiàn)有化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑的結(jié)構(gòu)類(lèi)型,為進(jìn)一步研發(fā)更加安全有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),具有重要意義。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R96
【部分圖文】：

多藥耐藥往往是造成化療失敗的主要原因，因此對(duì)多藥耐熱度不減，其中最重要的一個(gè)原因是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（sporter family）在耐藥細(xì)胞株中的高表達(dá)。運(yùn)蛋白是一類(lèi)具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的膜蛋白超家族，普遍存在中[41]，可以利用 ATP 水解釋放的能量，將底物分子逆濃-44]。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族龐大，目前共鑒定出 49 種蛋白，為 ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、A p-糖蛋白（ABCB1）為例，從結(jié)構(gòu)上看，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合區(qū)（nucleotide-binding domains ，NBDs）和 兩個(gè)跨brane binding domains，TMDs）[41, 45]。NBDs 的結(jié)構(gòu)和族中高度保守，包括 WalkerA和 Walker B序列、ATP 結(jié)合主要用于結(jié)合并水解 ATP，為 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用提構(gòu)和序列因其轉(zhuǎn)運(yùn)底物的不同而具有多樣性，其主要作用通過(guò)細(xì)胞膜。

圖 2.2 用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法評(píng)價(jià)化合物 25 在 2μM 的濃度下對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株SW620/AD300 的細(xì)胞毒作用表 2.5 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)耐藥細(xì)胞株 SW620/AD300 在部分化合物（2μM）作用下的存活率Compd. cell survival rate

圖 2.3 GV358 載體圖譜流程如圖2.4所示，利用限制性內(nèi)切酶消化獲得線性基因片段，最終使擴(kuò)增產(chǎn)物 5’和 3’的末端序列分別列完全相同。將線性化載體和目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行化。將重組產(chǎn)物直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑選平板上的單克
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本文編號(hào)：2841642