在臨床治療中,多藥耐藥的產生是化療失敗和腫瘤復發(fā)的最主要因素。腫瘤多藥耐藥產生的分子機制相對復雜,其中ATP結合盒轉運蛋白超家族(ABC家族)在腫瘤組織中高表達被認為是引起腫瘤多藥耐藥的主要原因。ABCB1(也稱為P-glycoprotein)是ABC轉運蛋白家族主要成員,已被發(fā)現在多種腫瘤組織高表達,如結腸癌、肝癌、前列腺癌等。ABCB1可以識別多種抗腫瘤化療藥物,如紫杉醇、喜樹堿類、蒽環(huán)霉素等,利用ATP水解釋放的能量,將其泵出腫瘤細胞外,使其在細胞內的濃度下降,進而導致化療藥物功效減弱甚至消失,最終產生多藥耐藥。將ABCB1抑制劑與傳統(tǒng)化療藥物聯用,降低ABCB1的表達或者活性,增加抗腫瘤藥物在耐藥細胞中的濃度,被認為是臨床上克服ABCB1介導的多藥耐藥非常有前景的策略。目前為止,現有的ABCB1抑制劑由于選擇性差、藥物相互作用及安全性等問題,限制了其臨床應用,因此,發(fā)現一種高效低毒、選擇性強的新型ABCB1抑制劑一直是解決腫瘤耐藥問題的研究熱點。本課題發(fā)現了三個系列的新型嘧啶類耐藥逆轉劑,對于ABCB1介導的腫瘤耐藥性具有不同程度的耐藥逆轉活性,并對其耐藥逆轉機制進行研究。本課題的研究結果和主要發(fā)現包括:(1)含1,2,3-三氮唑結構單元的嘧啶類衍生物對ABCB1介導的腫瘤耐藥性的逆轉作用及其機制研究(系列一)通過對課題組內的小分子化合物庫中約500個化合物進行初步篩選,發(fā)現含有1,2,3-三氮唑以及嘧啶結構單元的小分子化合物,能夠不同程度地逆轉ABCB1高表達結腸癌耐藥細胞株SW620/AD300對紫杉醇的耐藥性。同時文獻報道,含有嘧啶母核的酪氨酸激酶抑制劑(TKIs),如吉非替尼和厄洛替尼,也是ABCB1以及其他ABC轉運蛋白的抑制劑;且1,2,3-三氮唑結構單元也普遍應用在ABCB1抑制劑的設計合成中。基于篩選發(fā)現和文獻支持,結合分子拼合原理,最終發(fā)現了一類含1,2,3-三氮唑結構單元的嘧啶類新型耐藥逆轉劑(系列一)并對其耐藥逆轉機制進行研究。結果表明,系列一化合物對結腸癌耐藥細胞株SW620/AD300具有不同程度的耐藥逆轉活性,其中化合物15,17,25,34,36的逆轉活性明顯優(yōu)于ABCB1抑制劑Verapamil。構效關系分析發(fā)現1,2,3-三氮唑結構單元的引入對化合物逆轉耐藥活性的提升起到了重要作用。其中逆轉活性最好的化合物25對結腸癌耐藥細胞株SW620/AD300中ABCB1轉運蛋白的表達和細胞定位沒有影響,而是通過抑制ABCB1轉運蛋白的功能,增加紫杉醇在耐藥細胞中的蓄積量,使其達到細胞毒有效濃度,發(fā)揮抗腫瘤作用。(2)含雙酰胺、1,2,3-三氮唑結構單元的嘧啶類衍生物對ABCB1介導的腫瘤耐藥性的逆轉作用及其機制研究(系列二)在對化合物結構的進一步優(yōu)化中,基于系列一的結構基礎,我們一方面保留了對ABCB1抑制活性影響明顯的官能團,如1,2,3-三氮唑結構單元、鹵素基團、芳環(huán)基團、正電子基團等;另一方面引入具有潛在增強ABCB1抑制活性的芳環(huán)、雙酰胺結構單元,最終篩選得到一類含雙酰胺、1,2,3-三氮唑結構單元的嘧啶類衍生物(系列二)。相對于系列一,系列二化合物的耐藥逆轉活性并沒有得到提高,反而呈現下降的趨勢。分子對接結果確認了雙酰胺結構單元的加入的確增加了化合物與ABCB1轉運蛋白的氫鍵結合位點。另有研究表明,化合物的脂溶性對其能否結合于ABCB1轉運蛋白的疏水性藥物結合口袋至關重要,因此我們對比了兩個系列中的四組化合物(系列一化合物34,35,36,38與系列二化合物10,11,12,13)的脂溶性,結果顯示,系列二化合物10,11,12,13的脂溶性降低。綜合以上結果,我們推測雖然雙酰胺結構單元的加入增強了化合物與ABCB1的氫鍵相互作用,然而也導致化合物尺寸偏大,使部分官能團暴露在溶劑區(qū),脂溶性下降,降低了與ABCB1蛋白的疏水性藥物結合口袋的結合強度,最終導致活性下降。這為我們進一步優(yōu)化化合物結構,提升逆轉活性提供了方向。(3)含雙酰胺結構單元的嘧啶類衍生物對ABCB1介導的腫瘤耐藥性的逆轉作用及其機制研究(系列三)基于系列二的研究結果,我們去掉1,2,3-三氮唑結構單元以縮短分子尺寸,篩選得到一類含雙酰胺結構單元的嘧啶類衍生物(系列三),并且對其耐藥逆轉活性進行評價。實驗結果表明系列三化合物的耐藥逆轉活性整體上明顯優(yōu)于前兩個系列化合物,且系列三中化合物15,18,19,12對比于系列二中化合物27-29、34脂溶性也得到了提高,證實了脂溶性對提高化合物逆轉活性的重要性。我們選擇逆轉活性最好的化合物19做進一步的機制研究。結果表明化合物19同樣不影響結腸癌耐藥細胞株SW620/AD300中ABCB1轉運蛋白的表達和細胞定位,而是通過抑制ABCB1轉運蛋白的功能,增加紫杉醇在耐藥細胞中的蓄積量,使其達到細胞毒有效濃度,發(fā)揮抗腫瘤作用;通過ATPase活性實驗推測化合物19是一個ABCB1底物競爭性抑制劑,通過與紫杉醇競爭結合于ABCB1的藥物結合口袋,增加紫杉醇的細胞內濃度,從而逆轉耐藥;化合物19對CYP3A4(細胞色素P450 3A4)沒有明顯的抑制活性,表明該化合物可以做為一個安全有效的先導化合物;體內實驗結果證明化合物19也能夠在體內發(fā)揮耐藥逆轉活性,且毒副作用小,具有良好的應用前景。總之,結合分子拼合原理,經過多輪優(yōu)化篩選,最終發(fā)現了三個系列的新型嘧啶類耐藥逆轉劑,能夠在不同程度上逆轉ABCB1高表達結腸癌耐藥細胞株SW620/AD300對紫杉醇的耐藥性,極大地豐富了現有化學逆轉劑的結構類型,為進一步研發(fā)更加安全有效的耐藥逆轉劑提供了結構基礎,具有重要意義。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

多藥耐藥往往是造成化療失敗的主要原因，因此對多藥耐熱度不減，其中最重要的一個原因是ABC轉運蛋白家族（sporter family）在耐藥細胞株中的高表達。運蛋白是一類具有轉運活性的膜蛋白超家族，普遍存在中[41]，可以利用 ATP 水解釋放的能量，將底物分子逆濃-44]。ABC 轉運蛋白家族龐大，目前共鑒定出 49 種蛋白，為 ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、A p-糖蛋白（ABCB1）為例，從結構上看，ABC 轉運蛋白合區(qū)（nucleotide-binding domains ，NBDs）和 兩個跨brane binding domains，TMDs）[41, 45]。NBDs 的結構和族中高度保守，包括 WalkerA和 Walker B序列、ATP 結合主要用于結合并水解 ATP，為 ABC 轉運蛋白發(fā)揮作用提構和序列因其轉運底物的不同而具有多樣性，其主要作用通過細胞膜。

圖 2.2 用臺盼藍染色的方法評價化合物 25 在 2μM 的濃度下對結腸癌耐藥細胞株SW620/AD300 的細胞毒作用表 2.5 臺盼藍染色檢測耐藥細胞株 SW620/AD300 在部分化合物（2μM）作用下的存活率Compd. cell survival rate

圖 2.3 GV358 載體圖譜流程如圖2.4所示，利用限制性內切酶消化獲得線性基因片段，最終使擴增產物 5’和 3’的末端序列分別列完全相同。將線性化載體和目的基因擴增產物進行化。將重組產物直接進行轉化，挑選平板上的單克
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本文編號：2841642