目的:通過(guò)腹腔和腦室注射兩種不同給藥方式探究度拉糖肽對(duì)散發(fā)型和轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠對(duì)學(xué)習(xí)記憶的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:(1)SPF級(jí)9周齡雄性野生型C57/BL6小鼠隨機(jī)分為野生對(duì)照組(CON),模型組(STZ),度拉糖肽治療組(Dul)和抑制劑組(Ex),每組10只。造模前小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境一周,之后對(duì)STZ組、Dul組和Ex組小鼠進(jìn)行兩次雙側(cè)腦室重復(fù)注射STZ(3 mg/kg)建立散發(fā)型AD模型,三周成模后對(duì)Dul組小鼠每周腹腔注射度拉糖肽(12μmol/kg,無(wú)菌生理鹽水稀釋),Ex組小鼠每周給予度拉糖肽(12μmol/kg)和Ex9-39(0.8 g/kg),連續(xù)給藥4周。CON組和STZ組小鼠每天腹腔注射與處理組相同體積無(wú)菌生理鹽水。小鼠的體重每周監(jiān)測(cè)一次并做記錄,并分別記錄監(jiān)測(cè)小鼠在造模前、治療前和處死前的血糖水平,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)通過(guò)行為學(xué)方法用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,分別用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠腦組織內(nèi)的Tau蛋白和神經(jīng)絲(NFs)及其磷酸化水平,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突觸相關(guān)蛋白、Aβ、GLP-1和GLP-1R的表達(dá)水平和PI3K、AKT、GSK3β、CREB的磷酸化水平,尼氏染色標(biāo)記小鼠腦組織內(nèi)尼氏小體的變化和高爾基染色標(biāo)記小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞和突起。(2)SPF級(jí)9周齡雄性野生型C57/BL6小鼠和APP/PS1/Tau三重轉(zhuǎn)基因(3×Tg)小鼠采取隨機(jī)分組的方法進(jìn)行分組。野生型C57/BL6小鼠分為野生對(duì)照組(CON)、模型組(STZ)、低劑量度拉糖肽組(Dul(L),4μmol/kg)、高劑量度拉糖肽組(Dul(H),12μmol/kg)、低劑量度拉糖肽+抑制劑組(Dul(L)+Ex,4μmol/kg+0.8 g/kg)、高劑量度拉糖肽+抑制劑組(Dul(H)+Ex,12μmol/kg+0.8g/kg)和抑制劑組(0.8 g/kg),每組10只。除CON組外其余各組均進(jìn)行兩次重復(fù)雙側(cè)腦室注射STZ(3 mg/kg)建立散發(fā)型AD模型,三周成模后對(duì)各組小鼠按劑量每周腦室注射一次,每次處理時(shí)CON組小鼠均進(jìn)行相同體積的無(wú)菌生理鹽水的腦室注射。3×Tg小鼠隨機(jī)分為野生對(duì)照組(CON),轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(Tg),度拉糖肽組(Dul,4μmol/kg),度拉糖肽+抑制劑組(Dul+Ex,4μmol/kg+0.4g/kg)和抑制劑組(Ex,0.4 g/kg),腦室注射每周一次,CON組小鼠注射等體積的無(wú)菌生理鹽水。以上實(shí)驗(yàn)均持續(xù)4周。每周監(jiān)測(cè)記錄小鼠的體重,并分別記錄小鼠在造模前、治療前和處死前的血糖,轉(zhuǎn)基因組小鼠除記錄小鼠的體重外,并且記錄在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前和處死前小鼠的血糖,利用水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,免疫印跡檢測(cè)小鼠腦內(nèi)Tau蛋白和NFs及其磷酸化水平、突觸蛋白的表達(dá)水平、PI3K、AKT和GSK3β的磷酸化水平以及通路蛋白GSK3β的磷酸化水平。尼氏染色標(biāo)記小鼠腦組織內(nèi)尼氏小體的變化和高爾基染色標(biāo)記小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞和突起。結(jié)果:(1)散發(fā)型AD小鼠在各組之間血糖無(wú)明顯差異。Dul組小鼠的體重比STZ組下降,其他各組之間體重沒(méi)有明顯差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CON組相比,STZ組小鼠的游泳距離、逃避潛伏期明顯較長(zhǎng),在目的象限的時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯較少,Tau蛋白和神經(jīng)絲的磷酸化水平高,Aβ的聚積較多,CREB磷酸化水平降低,GLP-1和GLP-1R的表達(dá)量較少,突觸的長(zhǎng)度和分支都相對(duì)減小,突觸的可塑性下降。度拉糖肽治療后上述指標(biāo)均得到改善,小鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶的改善,AD樣的病理變化都有了一定程度的好轉(zhuǎn),加入抑制劑后各項(xiàng)指標(biāo)有不同程度的減弱或損傷,小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與Dul組相比下降,各項(xiàng)病理指標(biāo)都較Dul組小鼠加重。(2)腦室注射度拉糖肽處理后在STZ誘導(dǎo)的散發(fā)型AD小鼠組中發(fā)現(xiàn)體重有所下降,高劑量度拉糖肽較低低劑量度拉糖肽在改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶、降低Tau蛋白和神經(jīng)絲的磷酸化、增加突觸的表達(dá)量以及增加尼氏小體的數(shù)量、促進(jìn)突觸的再生都有明顯的作用,加入抑制劑后,小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降,Tau蛋白和神經(jīng)絲的磷酸化水平升高,突觸的表達(dá)水平降低,突觸的可塑性下降,尼氏小體的數(shù)量也下降,AD樣的病變較單獨(dú)給藥組改善不明顯。在AD模型小鼠基礎(chǔ)上繼續(xù)給抑制劑,小鼠AD樣病變加重。在轉(zhuǎn)基因小鼠中腦室注射度拉糖肽治療后,游泳距離和逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺(tái)的次數(shù)增加,Tau蛋白和神經(jīng)絲的磷酸化明顯減少,突觸蛋白表達(dá)水平和突觸的長(zhǎng)度和數(shù)量以及神經(jīng)生長(zhǎng)因子CREB都有不同程度的改善,加入抑制劑后以上指標(biāo)都有所下降或減少。結(jié)論:度拉糖肽通過(guò)減少Tau和神經(jīng)絲的磷酸化,促進(jìn)突觸的表達(dá),修復(fù)糖代謝通路的損傷進(jìn)而改善AD樣的病理變化。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.2.1.2 小鼠血糖的結(jié)果結(jié)果如圖1 B所示，從開(kāi)始造模前即第0天檢測(cè)并記錄各組小鼠的血糖水平，之后分別在開(kāi)始治療前即第 3 周和處死前即第 7 周分別記錄各組小鼠的血糖數(shù)據(jù)。根據(jù)測(cè)得的結(jié)果各組小鼠之間的血糖水平無(wú)顯著性差異。圖 1 小鼠體重和血糖的結(jié)果A 小鼠體重的變化（與 STZ 組相比，*P < 0.05）；B 小鼠血糖的變化1.2.2 散發(fā)型 AD 小鼠的 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠的游泳距離隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加逐漸縮短，小鼠更容易確定平臺(tái)位置。小鼠的逃避潛伏期在實(shí)驗(yàn)中也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，從一開(kāi)始漫無(wú)目的的尋找到直線式的變化，小鼠逐漸形成對(duì)隱匿平臺(tái)在水迷宮中的方位和位置的記憶。在訓(xùn)練的前兩天，各組小鼠的逃避潛伏期變化差異不明顯。多次重復(fù)訓(xùn)練后

19圖 3 小鼠腦組織中 Tau 蛋白蛋白免疫印跡和免疫熒光結(jié)果A 各組小鼠腦組織 Western Blotting 圖；B 磷酸化的 Tau 蛋白位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)圖；C 小鼠腦組織 Tau 蛋白 Ser199/202 位點(diǎn)的磷酸化免疫熒光結(jié)果（放大倍率 40X）(與CON 組相比，**P < 0.01；與 STZ 組相比，##P < 0.01)1.2.4 散發(fā)型 AD 小鼠腦組織中 NFs 蛋白的磷酸化水平1.2.4.1 小鼠腦組織 NFs 蛋白 Western Blotting 結(jié)果神經(jīng)絲是構(gòu)成神經(jīng)元細(xì)胞骨架的主要成分。以 R61d 抗體檢測(cè)總 NF-H（重鏈）和 NF-M（中鏈）作為內(nèi)參，SMI31 抗體檢測(cè)小鼠腦組織神經(jīng)絲蛋白 NF-H和 NF-M 磷酸化水平。結(jié)果如圖 4 所示，與 CON 組相比，STZ 組小鼠的神經(jīng)絲磷酸化水平升高，與 STZ 組相比，Dul 組小鼠腦組織的神經(jīng)絲磷酸化水平降低。加入抑制劑后，Ex 組小鼠的神經(jīng)絲磷酸化水平比 Dul 組又有升高,與 STZ 組小鼠的磷酸化水平無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 AD 樣小鼠腦內(nèi)神經(jīng)絲的過(guò)度磷酸化經(jīng)度拉糖肽治療后得到改善。

圖 4 小鼠腦組織中 NFs 蛋白免疫印跡和免疫熒光結(jié)果A 各組小鼠腦組織神經(jīng)絲蛋白 Western Blotting 結(jié)果；B 磷酸化的神經(jīng)絲蛋白水平統(tǒng)計(jì)圖；C 小鼠腦組織神經(jīng)絲蛋白 NF-H/M 磷酸化免疫熒光結(jié)果（放大倍率40X）(與 CON 組相比，*P < 0.05；與 STZ 組相比，#P < 0.05)1.2.4.2 各組小鼠腦組織中神經(jīng)絲蛋白的免疫熒光結(jié)果結(jié)果顯示，NFM 抗體標(biāo)記神經(jīng)絲總蛋白，SMI31 抗體標(biāo)記 NF-H/M 蛋白磷酸化蛋白，DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核，進(jìn)一步研究各組小鼠腦組織中神經(jīng)絲蛋白的磷酸化水平的改變。圖 4 C 中可見(jiàn) NFM 抗體標(biāo)記的皮質(zhì)區(qū)域顯示各組總神經(jīng)絲表達(dá)無(wú)明顯差別；SMI31 抗體標(biāo)記的皮質(zhì)區(qū)域顯示，STZ 組的神經(jīng)絲磷酸化水平明顯大于 CON 組和 Dul 組，Ex 組的神經(jīng)絲磷酸化水平比 Dul 組高，與 STZ 組的神經(jīng)絲磷酸化水平都較 CON 組和 Dul 組小鼠高（圖 4 C），說(shuō)明度拉糖肽能夠緩解散發(fā)型 AD 樣的病理改變，使腦組織神經(jīng)絲蛋白的過(guò)度磷酸化水平降低。1.2.5 散發(fā)型 AD 小鼠腦組織中神經(jīng)突觸蛋白的表達(dá)水平β-actin 作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)用 SAP97 抗體和 SP11 抗體分別檢測(cè)突觸相關(guān)蛋白
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