人血白蛋白和抗體是兩種重要的生物技術(shù)藥物,市場需求量大。以離子交換層析為代表的傳統(tǒng)人血白蛋白分離存在耐鹽性差、選擇性低等不足,以ProteinA親和層析為代表的經(jīng)典抗體分離過程存在介質(zhì)成本高、洗脫和再生困難等局限,開發(fā)新型分離方法具有重要意義�；旌夏Ｊ綄游�(MMC)具有吸附容量高、耐鹽性好、選擇性強等優(yōu)勢,適用于復(fù)雜料液的直接分離;高通量過程開發(fā)(HTPD)可快速、高效地篩選介質(zhì)和優(yōu)化分離條件,提高過程開發(fā)效率;示差掃描熒光法(DSF)可用于考察小分子配基和蛋白間的親和性,提高配基篩選效率。本文圍繞MMC,以重組人血白蛋白(rHSA)和人免疫球蛋白(hIgG)為分離目標,引入HTPD和DSF,實現(xiàn)蛋白層析分離的高通量過程開發(fā),探討新技術(shù)在人血白蛋白和抗體分離中的應(yīng)用。首先,建立了基于微孔過濾板的HTPD方法,優(yōu)化了操作參數(shù),考察了兩種離子交換介質(zhì)和四種MMC介質(zhì)對人血白蛋白的吸附和洗脫性能,并進行層析分離驗證。結(jié)果顯示,對于陰離子交換型介質(zhì)Q Sepharose FF和Capto adhere,pH 8.5和pH 5.5適合于HSA吸附,洗脫條件為pH 4.0;對于陽離子交換型介質(zhì)SP Sepharose FF、Capto MMC、MX-Trp-650M 和 NuviacPrime,最佳上樣條件為 pH 4.0,洗脫條件分別為pH 7.0、pH8.0和pH 9.0。在優(yōu)化的分離條件下,柱層析與高通量篩選結(jié)果相一致,六種介質(zhì)均有較高的動態(tài)結(jié)合載量DBC10%和大于95%的洗脫收率。其次,以畢赤酵母發(fā)酵液中分離rHSA為目標,采用HTPD方法,考察了兩種離子交換介質(zhì)和四種MMC介質(zhì)的吸附選擇性和洗脫性能。發(fā)現(xiàn)陽離子交換型介質(zhì)的吸附容量和選擇性均明顯優(yōu)于陰離子交換型介質(zhì),尤其是MMC介質(zhì)Capto MMC和MX-Trp-650M。洗脫優(yōu)化結(jié)果顯示,MX-Trp-650M介質(zhì)的洗脫條件溫和,收率和純度高。進一步柱層析結(jié)果表明,MX-Trp-650M介質(zhì)的吸附容量大、耐鹽性強、選擇性好、洗脫溫和、宿主細胞蛋白和色素去除能力強。在最佳上樣pH 4.0、不稀釋料液條件下,DBC10%為49.8 mg/mL,pH 8.0洗脫收率為97.1%,純度為 97.0%,HCP 為 581 ppm,A350/A280為0.12。將層析柱 MX-Trp-650M介質(zhì)體積放大20倍,分離效果與1 mL層析柱一致,收率為94.8%,純度為95.9%,HCP含量為415ppm。建立了 DSF方法用于蛋白分離配基篩選,發(fā)現(xiàn)熒光染料SYPRO Orange無法用于人血白蛋白,但可以用于IgG,并優(yōu)化了 DSF條件。針對人免疫球蛋白hIgG和單克隆抗體(mAb),選擇33個小分子為潛在的MMC配基,采用DSF方法探討了配基與hIgG和mAb的親和性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對于課題組前期研發(fā)的三種配基,ABI親和力最強,其次為MEP,MMI最弱。以MMI的△Tm為低親和性指標,MEP為一般親和性指標,ABI為高親和性指標,分析了其它分子對抗體的親和性,考察了 pH和鹽濃度的影響。發(fā)現(xiàn)不加鹽時,在pH 5.0-8.0范圍內(nèi),隨著pH升高,熔融溫度差△Tm先增大后減小;加鹽后,△Tm基本保持不變,顯示出較好的耐鹽吸附性。經(jīng)比較分析,發(fā)現(xiàn)六個小分子(PCA、6-ABT、BPA、BIA、IAAH和SFA)對hIgG和mAb的親和性都較高,處于ABI和MEP之間,具有抗體高效結(jié)合的潛力。以瓊脂糖凝膠為基質(zhì),偶聯(lián)DSF篩選得到的PCA、6-ABT、BPA、BIA、IAAH和SFA配基,制備六種MMC新介質(zhì),考察了 hIgG和pHSA的吸附能力,并與MEP和ABI介質(zhì)比較。發(fā)現(xiàn)BPA-B-6FF和SFA-B-6FF介質(zhì)的hIgG吸附容量大,耐鹽性強,選擇性高。pH 7.4和流速102 cm/h下,ABI-B-6FF動態(tài)載量高,耐鹽性強,但選擇性一般;BPA-B-6FF動態(tài)載量和選擇性均較高,但耐鹽性差,需在低電導(dǎo)率下捕獲抗體;SFA-B-6FF動態(tài)載量和選擇性均較高,耐鹽性適中,可在較廣的電導(dǎo)率下捕獲抗體。SFA-B-6FF用于人血清中分離抗體,抗體純度達99.1%,hIgG純度為87.5%;若血清稀釋4倍,抗體和hIgG純度保持不變,收率增大到83.8%。結(jié)果表明,SFA-B-6FF介質(zhì)對hIgG選擇性好,pH洗脫范圍廣,耐鹽性適中,具有從血清中特異性分離免疫球蛋白的能力。本文圍繞MMC分離新方法,采用HTPD篩選了人血白蛋白分離的合適介質(zhì)和分離條件,并利用DSF篩選了抗體分離的合適配基,制備了新型MMC介質(zhì),探討了 rHSA和hIgG分離新過程,實現(xiàn)了實際料液的高效分離純化,為MMC應(yīng)用打下了良好基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R914
【部分圖文】：

１＿２．１人血白蛋白的結(jié)構(gòu)與功能??ＨＳＡ含有５８５個氨基酸殘基，分子量６６．５ｋＤａ氣等電點約４．７Ｗ２５，約占血漿總蛋白??的６０?％左右＾ＨＳＡ在肝臟中合成，以非糖基化單鏈形式輸出。ＨＳＡ結(jié)構(gòu)見圖１．１，約??６７％為ｃｘ螺旋，由三種同源結(jié)構(gòu)域組成（Ｉ、１丨、ｍ），不同結(jié)構(gòu)域之間通過末端無規(guī)卷曲??相連２７。每個結(jié)構(gòu)域由兩個獨立、螺旋的子域組成（Ａ和Ｂ），分別包含四個和六個ａ螺??旋，通過脯氨酸殘基形成的柔性環(huán)或者域間二硫鍵，子域相對于彼此移動，改變分子的空??２??

發(fā)揮免疫功能＇人血液中含有五種免疫球蛋白ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ和ＩｇＥ，其中ＩｇＧ??含量最高，約占血漀蛋白的Ｈ）？２０?％氣??ＩｇＧ結(jié)構(gòu)如圖１．２所示，呈“Ｙ”型，分子量約為１５０ｋＤａ，由兩條５０ｋＤａ的丫型重??５??

疏水相互作用層析（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，?ＨＩＣ）或羥基鱗灰石層析??（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，?ＨＡＣ）等兩種層析組合實現(xiàn)抗體的精制分離。??典型的抗體分離流程如圖１．３所示，包括抗體捕獲和純化精制兩個階段。分離純化過??程中，需要關(guān)注過程相關(guān)雜質(zhì)（如宿主細胞蛋白水平、ＤＮＡ含量、內(nèi)毒素、ＰｒｏｔｅｉｎＡ泄??漏和細胞培養(yǎng)添加劑）、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（抗體聚集體和片段）以及病毒去除率等７氣??（１）抗體捕獲??Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ公司７４?７５的研究人員采用Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａ親和層析從動物細胞培養(yǎng)液中捕獲??ｍＡｂ。以ＣＨＯ細胞作為表達體系，ｍＡｂ分泌到細胞培養(yǎng)液，具體捕獲步驟如下：（Ｉ）??料液預(yù)處理。采用離心方式去除ＣＨＯ細胞和碎片，控制過濾膜孔徑和流量，通過深層過??濾（Ｄｅｐｔｈｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）去除部分宿主細胞蛋白（ＨＣＰｓ）。（ＩＩ）?ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和層析捕獲。??８??
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本文編號：2836305