目前,商業(yè)化生物芯片大部分使用的是硅烷試劑修飾玻片制備的基片,該類基片一致性和穩(wěn)定性差的問題影響到了生物芯片的使用性能,例如同批次和批次間的重現(xiàn)性。另外,基片還存在化學(xué)偶聯(lián)基團(例如琥珀酰亞胺酯,NHS)易于水解的問題。現(xiàn)有研究多集中在玻片表面的硅烷化和后續(xù)化學(xué)偶聯(lián)技術(shù),不能從根本上解決硅烷化反應(yīng)的不可控性帶來的問題。本文選取二乙烯基砜(DVS)代替硅烷試劑進行玻片硅羥基修飾,共價鍵引入乙烯基砜(VS)偶聯(lián)基團,制備了一種性能優(yōu)異的核酸芯片基片。首先,本論文研究了有機堿催化劑、溫度、反應(yīng)物濃度等反應(yīng)條件對Si-OH修飾反應(yīng)的影響。結(jié)果表明該反應(yīng)具有很高的可控性,通過改變催化劑、溫度和反應(yīng)物濃度均可以調(diào)節(jié)VS偶聯(lián)基團的表面密度。其次,采用Sulfo-Cyanine 3 amine(Sulfo-Cy3-NH_2)熒光分子,基于熒光強度評價了VS基片固定分子的化學(xué)反應(yīng)活性。研究表明,表面VS基團在堿性條件下具有很高反應(yīng)的活性,且與商業(yè)化的醛基基片比較,VS基片具有更高的固定密度。通過改變Sulfo-Cy3-NH_2濃度和反應(yīng)時間能夠獲得不同的固定密度。實驗表明VS基片在pH≤9和高濕度環(huán)境都具有很高的穩(wěn)定性,且VS基片與玻片同樣具有非常低的熒光背景。芯片點樣打印實驗表明,VS基片適合于接觸式點樣打印,所制備的樣點形狀規(guī)則,信號均一。然后,將VS基片用于制備核酸芯片,并對核酸固定和雜交性能進行了考評。通過改變核酸探針濃度得到不同密度的核酸芯片,在核酸探針濃度為80μmol/L,芯片核酸探針密度達到2.7±0.1 pmol/cm~2。核酸雜交實驗表明,VS基片表面固定的核酸探針具有良好的空間分布,雜交效率達到64.3%,且雜交信號一致性高,檢測限達到4×10~(-14)mol/L。將4℃干燥環(huán)境長期放置的VS基片用于核酸探針打印,結(jié)果表明該類基片在空氣中長期穩(wěn)定。與商業(yè)化的NHS基片比較,VS基片也表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。此外,本論文使用雙(乙烯基磺酰)甲烷(BVS)制備了一種高反應(yīng)活性的VS表面,將巰基衍生的甘露糖分子固定于兩種VS表面。使用生物膜層干涉(BLI)技術(shù)研究固定的巰基甘露糖結(jié)合Con A的能力和選擇性。綜上,本論文基于DVS與硅羥基的邁克爾加成反應(yīng)制備了一種新型的核酸芯片基片,相比于傳統(tǒng)基片具有制備制備過程可控、一致性好、穩(wěn)定性高的優(yōu)勢。
【學(xué)位單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R91
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 生物芯片概述
    1.2 微陣列雜交型芯片的分類
    1.3 微陣列雜交型芯片的制備
        1.3.1 制備方法
        1.3.2 探針固定方法
    1.4 微陣列雜交型芯片的雜交性能
    1.5 信號檢測
    1.6 微陣列生物芯片研究面臨的問題
        1.6.1 基片制備的一致性問題
        1.6.2 基片的穩(wěn)定性問題
    1.7 本文的研究目的和內(nèi)容
2 乙烯基砜(VS)基片的制備
    2.1 引言
    2.2 實驗儀器與試劑
    2.3 實驗操作
        2.3.1 硅片的清洗
        2.3.2 催化劑篩選
        2.3.3 溫度篩選
        2.3.4 DVS濃度篩選
        2.3.5 X射線光電子能譜(XPS)表征
        2.3.6 VS基片的制備
    2.4 實驗結(jié)果與討論
        2.4.1 催化劑篩選
        2.4.2 溫度的影響
        2.4.3 DVS的濃度篩選
        2.4.4 X射線光電子能譜(XPS)表征
        2.4.5 VS基片的制備
    2.5 小結(jié)
3 乙烯基砜(VS)基片的性能
    3.1 引言
    3.2 實驗儀器與試劑
    3.3 實驗操作
        3.3.1 VS基片表面化學(xué)反應(yīng)活性
        3.3.2 VS基片在不同pH條件下的穩(wěn)定性
        3.3.3 高濕度環(huán)境對VS基片穩(wěn)定性的影響
        3.3.4 VS基片的光學(xué)性能
        3.3.5 VS基片封閉試劑篩選
        3.3.6 VS基片點樣實驗
    3.4 實驗結(jié)果與討論
        3.4.1 VS表面化學(xué)反應(yīng)活性
        3.4.2 VS基片在不同pH溶液中的穩(wěn)定性
        3.4.3 高濕度環(huán)境對VS基片穩(wěn)定性的影響
        3.4.4 VS基片的光學(xué)性能
        3.4.5 封閉試劑的篩選
        3.4.6 VS基片的點樣實驗
    3.5 小結(jié)
4 核酸芯片的制備和表征
    4.1 引言
    4.2 實驗儀器與試劑
    4.3 實驗操作
        4.3.1 探針的固定
        4.3.2 樣品雜交實驗
        4.3.3 核酸芯片的檢測限
        4.3.4 核酸芯片的選擇性
        4.3.5 VS基片長時間放置后的探針固定性能
        4.3.6 NHS基片對照實驗
    4.4 實驗結(jié)果與討論
        4.4.1 探針固定實驗
        4.4.2 樣品雜交實驗
        4.4.3 基因芯片的檢測限
        4.4.4 核酸芯片的選擇性
        4.4.5 VS基片的長期穩(wěn)定性
        4.4.6 商業(yè)的NHS基片對照實驗
    4.5 小結(jié)
5 糖芯片的制備和表征
    5.1 引言
    5.2 試劑和儀器
    5.3 實驗操作
        5.3.1 VS化表面的制備
        5.3.2 糖的合成和固定
        5.3.3 基于生物膜層干涉(BLI)技術(shù)的選擇性研究
        5.3.4 基于生物膜層干涉(BLI)技術(shù)的雜交性能研究
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 VS化表面的制備
        5.4.2 糖的合成和固定
        5.4.3 基于生物膜層干涉(BLI)技術(shù)的選擇性研究
        5.4.4 基于生物膜層干涉(BLI)技術(shù)的雜交性能研究
    5.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝

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