阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,病理機(jī)制復(fù)雜,目前臨床上尚無(wú)病因性治療藥物。最新研究發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺酰基環(huán)化酶(Glutaminyl Cyclase,QC)特異性高表達(dá),可通過(guò)催化產(chǎn)生神經(jīng)毒性pEAβ等途徑誘發(fā)、加速AD發(fā)病,是AD發(fā)病早期的特異性病理變化。因此,QC靶向高活性分子的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)理研究對(duì)病因性抗AD藥物研發(fā)意義重大。前期研究中,本課題組率先設(shè)計(jì)、合成、發(fā)現(xiàn)了具有顯著抗AD作用的DPCI系列QC抑制劑,本文中則對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了探索性研究,主要包括:(1)以代表性化合物DPCI-23為主要研究對(duì)象,選擇PC12細(xì)胞模型,GD-QC酶聯(lián)法、ELISA測(cè)試發(fā)現(xiàn),與DPCI-23共培養(yǎng)后,PC12細(xì)胞內(nèi)QC酶活性被顯著抑制,pEAβ含量明顯降低,在一定作用濃度和時(shí)間范圍內(nèi),呈劑量和時(shí)間依賴性,這表明該化合物可抑制細(xì)胞內(nèi)QC活性,減少pEAβ的產(chǎn)生。(2)RNA-seq分析發(fā)現(xiàn),DPCI-23刺激12h后,PC12細(xì)胞內(nèi)11個(gè)基因顯著上調(diào),14個(gè)基因顯著下調(diào);DPCI-23刺激24h后,PC12細(xì)胞內(nèi)13個(gè)基因顯著上調(diào),15個(gè)基因顯著下調(diào)。差異基因GO功能和KEGG通路注釋分類統(tǒng)計(jì)分析表明,Ribosome等為顯著富集通路,HSP70、HSP90、Actin為共性顯著差異表達(dá)基因,結(jié)果表明DPCI-23的作用與蛋白生成和穩(wěn)態(tài)調(diào)控有關(guān)。(3)為驗(yàn)證RNA-seq分析結(jié)果,本文進(jìn)一步運(yùn)用RT-qPCR、Western Blot等方法對(duì)Ribosome通路進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)DPCI-23處理后,PC12細(xì)胞內(nèi)RPL37、RPL38、RPS18基因表達(dá)上調(diào),RPS17基因表達(dá)水平下調(diào),與RNA-seq的結(jié)果基本一致。RPS6基因表達(dá)水平和總RPS6的蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性變化,但磷酸化水平顯著降低。以上結(jié)果表明DPCI-23可增強(qiáng)細(xì)胞核糖體的蛋白質(zhì)合成功能。(4)采用RT-qPCR、Western Blot、ELISA、免疫熒光等方法研究發(fā)現(xiàn),DPCI-23作用后,PC12細(xì)胞內(nèi)HSP70基因表達(dá)水平升高時(shí),HSP90基因水平無(wú)明顯變化;當(dāng)HSP70基因表達(dá)水平降低時(shí),HSP90基因表達(dá)增加,HSP90/HSP70的蛋白水平也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì);Actin的基因與蛋白表達(dá)水平均明顯降低,共性顯著差異基因蛋白表達(dá)水品及變化趨勢(shì)與RNA-seq分析結(jié)果基本一致,進(jìn)一步說(shuō)明了DPCI-23的作用與修復(fù)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。綜上所述,本文首次研究了高活性QC抑制劑DPCI-23對(duì)PC12模型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控作用,基于RNA、基因、蛋白等水平的研究結(jié)果,共同表明DPCI-23的作用與Ribosome通路、HSP70、HSP90、Actin、RPS6等蛋白調(diào)控相關(guān),提示QC抑制劑的抗AD作用可能是通過(guò)其對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白生成和穩(wěn)態(tài)失衡的促進(jìn)和改善而實(shí)現(xiàn)的,該研究為闡明QC抑制劑類抗AD先導(dǎo)物作用機(jī)理提供了很好的支持,積極推動(dòng)了創(chuàng)新抗AD藥物的研究工作。
【學(xué)位單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

圖 1-1 蛋白平衡網(wǎng)絡(luò)圖成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，主要成分是核糖體蛋白質(zhì)（Ribosomal P（Ribosomal RNA，rRNA），其中前者占總成分的 40%，后者基，將核糖體蛋白分別命名為 RPL（Ribosomal Protein Larotein Small）[34]。核糖體的主要功能是將基因翻譯成蛋白質(zhì)，核糖核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)，核糖核酸剪切、修飾，細(xì)胞信分化，誘導(dǎo)耐藥等功能（圖 1-2）。相關(guān)研究結(jié)果表明核糖體，例如在先天性貧血、生長(zhǎng)發(fā)育不全和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程用[34, 35]。

圖 1-1 蛋白平衡網(wǎng)絡(luò)圖體體是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，主要成分是核糖體蛋白質(zhì)（Ribosomal P RNA（Ribosomal RNA，rRNA），其中前者占總成分的 40%，后者大小亞基，將核糖體蛋白分別命名為 RPL（Ribosomal Protein Laral Protein Small）[34]。核糖體的主要功能是將基因翻譯成蛋白質(zhì)，控脫氧核糖核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)，核糖核酸剪切、修飾，細(xì)胞信亡、分化，誘導(dǎo)耐藥等功能（圖 1-2）。相關(guān)研究結(jié)果表明核糖體切相關(guān)，例如在先天性貧血、生長(zhǎng)發(fā)育不全和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程重要作用[34, 35]。

并具有顯著的病理意義[69]。Aβ 被異常地截短后，正常情lu 暴露在 N-端，可被環(huán)化為 pGlu，形成 Aβ3(pE)-40/42 或 Aβ11毒性、與細(xì)胞膜的相互作用等方面的性質(zhì)產(chǎn)生影響[70]。pEAβ 修能抵抗多種常見(jiàn)氨肽酶的水解，使之難以被代謝清除，體內(nèi)半電荷的減少，pEAβ 具有強(qiáng)烈的形成低聚物的趨勢(shì)，聚合速率，快速形成的 Aβ3(pE)-42 聚合體會(huì)改變細(xì)胞膜的滲透性，具外，pEAβ 還可以觸發(fā)和加速 Aβ 聚合形成纖維[71]。Schlenzig 等β 的生物化學(xué)和生物物理性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) N 末端 pGlu 依賴性溶解度分布，使得 pGlu 修飾的肽在堿性 pH 范圍內(nèi)溶的形成[72]。該研究提供了 pGlu 修飾對(duì)結(jié)構(gòu)上不同的淀粉樣pEAβ 可能促進(jìn)了分子獨(dú)特的神經(jīng)退行性疾�。ㄈ� AD）。目前絕大部分 Aβ 肽環(huán)化形成焦谷氨酸（pGlu）（圖 1-3），因此認(rèn)是 pEAβ[73-75]。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2834474