第一部分MDM4在參與甲基苯丙胺激活小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用機(jī)制研究研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一種神經(jīng)興奮性人工合成毒品,屬于苯丙胺類興奮劑之一,其分子結(jié)構(gòu)類似于神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺,易溶于水、酒精等溶劑,因外觀類似冰晶,故又稱“冰毒”,在世界各國(guó)廣泛濫用,其危害公共衛(wèi)生及社會(huì)安全的趨勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)重,是目前全球范圍內(nèi)對(duì)公共衛(wèi)生及社會(huì)安全危害最嚴(yán)重的毒品之一。METH最開始是作為一種控制食欲的藥物在使用,后衍變?yōu)榫耦惗酒?其可以給吸食者帶來(lái)短暫的身心愉悅的狀態(tài),與此同時(shí)也帶來(lái)危害嚴(yán)重的副作用。吸食甲基苯丙胺后主要對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及肝、腎等臟器造成損傷。目前已有文獻(xiàn)表明:甲基苯丙胺毒性作用的靶器官是人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng),可以導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的凋亡自噬、星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和自噬及可引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活等反應(yīng),上述中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞的功能紊亂也可以導(dǎo)致如亨廷頓、帕金森等神經(jīng)性退行性變癥狀的出現(xiàn),最終影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。本課題組一直致力于甲基苯丙胺神經(jīng)毒性研究,本課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺能夠引起神經(jīng)元凋亡及星膠的炎癥反應(yīng)。除此之外,亦有大量臨床及死后病理解剖數(shù)據(jù)顯示,長(zhǎng)期吸食冰毒者的腦部除存在神經(jīng)元凋亡、星形膠質(zhì)細(xì)胞激活,還伴隨著神經(jīng)炎癥反應(yīng)的存在。神經(jīng)炎癥反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中扮演著十分重要的角色。神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)同中樞神經(jīng)系統(tǒng)中間質(zhì)細(xì)胞(如星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞)有著密切的關(guān)系,尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞,其約占腦中細(xì)胞數(shù)量的10-20%之間,數(shù)量同神經(jīng)元數(shù)量相當(dāng),位于大腦應(yīng)對(duì)外來(lái)有害刺激的最前線。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種特化的免疫細(xì)胞,它的存在在維持腦正常功能發(fā)揮著重要的作用,可以不斷清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其他細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的凋亡小體、外來(lái)物質(zhì)、局部感染等,在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著十分重要的作用,尤其是在帕金森、多發(fā)性硬化及阿爾茨海默癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程中。前期本課題組主要研究?jī)?nèi)容是METH所致神經(jīng)元凋亡、自噬及METH誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥通路機(jī)制的研究等,在此基礎(chǔ)上,開展了微小RNA(micro RNA,miRNA)對(duì)METH所誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥調(diào)控作用的研究。在METH導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥細(xì)胞模型中,通過miRNA芯片檢測(cè)篩選到差異性表達(dá)的miRNA,其中miR-10lb-3p上調(diào)明顯。根據(jù)miR-10lb-3p的RNA序列,利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選到MDM4是miR-10lb-3p調(diào)控的可能靶點(diǎn)。但在隨后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),miR-l0lb-3p對(duì)MDM4的調(diào)控作用甚微,MDM4對(duì)自噬及炎癥的調(diào)控存在一定作用但效果并不穩(wěn)定且不顯著,故研究重心從miR-10lb-3p對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥的調(diào)控機(jī)制研究轉(zhuǎn)移到MDM4對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥的調(diào)控機(jī)制研究。但MDM4在星形膠質(zhì)細(xì)胞中對(duì)自噬及炎癥的調(diào)控存在一定作用但效果并不穩(wěn)定且不顯著,推測(cè)可能是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞并非中樞神經(jīng)系統(tǒng)的專職炎癥細(xì)胞而導(dǎo)致的。意外的是,雖然MDM4在METH導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的調(diào)控作用不明顯,但在研究中發(fā)現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),METH可誘導(dǎo)MDM4表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬及炎癥的發(fā)生,且MDM4對(duì)自噬及炎癥的調(diào)控效果顯著。這一結(jié)果,促使了我們對(duì)MDM4的上調(diào)與自噬的發(fā)生及炎癥的激活三者之間的關(guān)系產(chǎn)生強(qiáng)烈的探討興趣,擬通過本研究對(duì)METH處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中MDM4、自噬及炎癥的相互調(diào)控關(guān)系的研究,探討甲基苯丙胺在激活小膠質(zhì)細(xì)胞中的可能作用機(jī)制。目的:本研究擬通過建立METH神經(jīng)毒性體外模型,利用免疫學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù),探討在METH誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活中MDM4的作用機(jī)制,并通過分子生物學(xué)手段調(diào)控MDM4的表達(dá),檢測(cè)MDM4對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的調(diào)控作用及可能涉及到的分子通路,從而研究METH誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的可能分子機(jī)制,為進(jìn)一步明確MDM4在METH激活小膠質(zhì)細(xì)胞活性中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)方法:1.METH誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬及MDM4升高模型建立(l)接種BV2細(xì)胞細(xì)胞至6孔板中,5%C02和37℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞,待長(zhǎng)至60-80%匯合程度時(shí),分別用溶于2%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基的METH濃度為0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、lmmol/L、2mmol/L、3mmol/L處理24小時(shí)。提取總蛋白,Western Blot檢測(cè)MDM4的表達(dá)水平及自噬相關(guān)分子的表達(dá)水平,根據(jù)METH濃度梯度處理后MDM4的變化趨勢(shì)確定合適的METH給藥濃度。(2)根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中MDM4及自噬的變化趨勢(shì),選擇最適合的METH處理濃度,并以該濃度處理0h、6h、12h、24h、36h及48h,以此建立時(shí)間梯度處理實(shí)驗(yàn),處理相應(yīng)時(shí)間后,提取總蛋白,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞MDM4的表達(dá)水平及自噬的分子的表達(dá)水平,根據(jù)METH時(shí)間梯度處理后MDM4的變化趨勢(shì)確定合適的METH給藥時(shí)間。2.MDM4在小膠質(zhì)細(xì)胞自噬、活化中作用(1)根據(jù)MDM4的mRNA序列,設(shè)計(jì)MDM4的siRNA干擾片段,使用lipo-3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書的方法轉(zhuǎn)染siRNA,將BV2分為8組,分別是空白對(duì)照、對(duì)照+小干擾1、對(duì)照+小干擾2、對(duì)照+小干擾3、給藥組、給藥+小干擾1、給藥+小干擾2、給藥+小干擾3,處理24小時(shí)后,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞MDM4的表達(dá)水平自噬及炎癥反應(yīng)的變化情況,根據(jù)結(jié)果選擇有效的特異性siRNA。(2)選擇MDM4特異性化學(xué)抑制劑GSC-207895,根據(jù)既有文獻(xiàn)推薦的濃度,設(shè)置5個(gè)濃度梯度,范圍濃度分別為0μM/L、1μM/L、2μM/L、3μM/L、4μM/L,預(yù)處理24h,之后給予終濃度為2mM的METH處理24小時(shí),提取細(xì)胞總蛋白,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞MDM4的表達(dá)水平自噬及炎癥反應(yīng)的變化情況。3.MDM4通過自噬途徑介導(dǎo)METH誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化(1)根據(jù)ATG5的mRNA序列,設(shè)計(jì)ATG5的siRNA干擾片段,使用lipo-3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書的方法轉(zhuǎn)染siRNA,將BV2分為4組,分別是空白對(duì)照組、對(duì)照+小干擾、給藥組、給藥+小干擾,處理24小時(shí)后,Western Blot檢測(cè)MDM4的表達(dá)水平自噬相關(guān)分子的表達(dá)水平,并利用qRT-PCR檢測(cè)炎癥因子變化水平。(2)選擇自噬特異性化學(xué)抑制劑3-MA,根據(jù)既有文獻(xiàn)推薦的處理濃度及時(shí)間即2mM,處理24h后,給予終濃度為2mM的METH處理24小時(shí),分為4組,分別是METH(-)3MA(-)組、METH(-)3MA(+)組、METH(+)3MA(-)組及METH(+)3MA(+)組,Western Blot檢測(cè)MDM4的表達(dá)水平及自噬相關(guān)分子的表達(dá)水平,并利用qRT-PCR檢測(cè)炎癥因子變化水平。結(jié)果:1.METH誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬及MDM4升高模型建立(1)分別以0mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L和3 mmol/L終濃度METH處理BV2細(xì)胞,Western Blot結(jié)果顯示MDM4隨著METH處理濃度的升高,呈先上升后下降的趨勢(shì),MDM4的表達(dá)量在2 mmol/L時(shí)比0 mmol/L的control組相比顯著升高,自噬表達(dá)趨勢(shì)同MDM4表達(dá)趨勢(shì)。(2)用2 mmol/L METH終濃度分別處理BV2細(xì)胞0h、6h、12h、24h、36h、48h,Western Blot結(jié)果顯示MDM4隨著METH作用時(shí)間的增長(zhǎng),MDM4蛋白水平也隨著上升,MDM4的蛋白表達(dá)在METH處理6小時(shí)后開始上升,在24小時(shí)達(dá)到峰值,后續(xù)基本維持較高水平,48小時(shí)開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。2.MDM4在小膠質(zhì)細(xì)胞自噬、活化中作用(1)使用MDM4 siRNA Oligo片段處理后,同METH組相比較,MDM4蛋白表達(dá)存在下降趨勢(shì)。使用METH+siRNA3,MDM4的表達(dá)量同METH組相比下降明顯最明顯,使用METH+siRNA1或METH+siRNA2,MDM4的表達(dá)量同METH組相比下降不明顯。同時(shí)檢測(cè)自噬與炎癥Maker基因,結(jié)果顯示,與control組相比較,METH組自噬及炎癥蛋白表達(dá)水平均有上升;而METH+小干擾組同METH組相比,相關(guān)蛋白表達(dá)降低。(2)選擇MDM4特異性化學(xué)抑制劑GSC-207895,設(shè)置5個(gè)濃度梯度,范圍濃度分別為0μM/L、1μM/L、2μM/L、3μM/L、4μM/L,預(yù)處理24h,之后給予終濃度為2mM的METH處理24小時(shí),同METH組相比,MDM4的表達(dá)水平隨MDM4特異性化學(xué)抑制劑GSC-207895升高,呈現(xiàn)先降低的趨勢(shì),自2mM起開始明顯抑制MDM4的表達(dá),3mM達(dá)到頂峰。同時(shí)檢測(cè)自噬與炎癥相關(guān)標(biāo)志基因,結(jié)果如下,與METH組相比;而METH+GSC-207895同METH組比較而言,自噬、炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)降低。3.MDM4經(jīng)自噬通路介導(dǎo)METH誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化(1)使用ATG5 siRNA Oligo處理之后發(fā)現(xiàn),同METH相比較,ATG5的表達(dá)下調(diào)。同時(shí)檢測(cè)自噬與炎癥相關(guān)分子表達(dá)水平,結(jié)果如下,與Control組相比,METH組自噬及相關(guān)炎癥分子表達(dá)上調(diào);而METH+小干擾同METH組比較而言,MDM4沒有變化,僅炎癥相關(guān)分子的表達(dá)降低。(2)選擇自噬特異性化學(xué)抑制3-MA,,以終濃度2mM預(yù)處理24h,之后給予終濃度為2mM的METH處理24小時(shí),同時(shí)檢測(cè)自噬與炎癥相關(guān)分子的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與METH組相比,METH+3MA組MDM4沒有變化,自噬相關(guān)分子下降明顯,炎癥分子下降明顯。結(jié)論:1.METH處理BV2細(xì)胞MDM4及自噬通路分子升高。2.METH處理BV2細(xì)胞后,敲低MDM4及使用MDM4抑制劑處理后,MDM4下降,自噬及炎癥通路分子下降,提示MDM4調(diào)控自噬及炎癥的發(fā)生。3.METH處理BV2細(xì)胞后,敲低ATG5及使用自噬抑制劑處理后,MDM4沒有明顯改變,自噬及炎癥通路分子下降,提示自噬位于MDM4下游及炎癥通路的上游。第二部分木犀草素緩解甲基苯丙胺肝毒性機(jī)制初探研究背景:本課題組在研究甲基苯丙胺中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害作用的同時(shí),亦有針對(duì)性的篩選拮抗甲基苯丙胺中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的天然藥物。木犀草素(Luteolin)是一種黃酮類天然化合物,主要存在于水果、蔬菜及草藥中,大量文獻(xiàn)報(bào)道木犀草素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學(xué)活性,尤其是其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮的相關(guān)作用:Fu.H.Sun,Y等報(bào)道木犀草素能夠減輕因脊髓缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及凋亡;Y.Kwon報(bào)道了木犀草素可能成為阿爾茨海默癥潛在的治療藥物;S.F.Nabavi等報(bào)道了在大鼠體內(nèi)木犀草素能夠緩解αβ肽所致的認(rèn)知障礙;M.Zuiki等證實(shí)木犀草素能夠緩解由多能干細(xì)胞所分化神經(jīng)元分泌的IL-6導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。基于上述關(guān)于木犀草素緩解中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的文獻(xiàn)報(bào)道,我們嘗試假設(shè)木犀草素能夠緩解METH所致的神經(jīng)毒性。因木犀草素主要是是依靠經(jīng)過體內(nèi)代謝的活性成分發(fā)揮其生物學(xué)作用。故驗(yàn)證木犀草素緩解METH所致中樞神經(jīng)毒性的模型在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行。遺憾的是,前期多次預(yù)實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)木犀草素能減緩METH所致神經(jīng)毒性的作用,意外的是,在對(duì)預(yù)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行系統(tǒng)病理檢查的過程中,發(fā)現(xiàn)METH對(duì)肝臟造成的肝毒性可被木犀草素緩解。后又進(jìn)行多次動(dòng)物實(shí)驗(yàn),病理學(xué)顯示木犀草素確實(shí)能夠有效減輕METH所致肝毒性,另亦有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道木犀草素能夠緩解由四氯化碳、氯化汞、酒精等毒藥物所導(dǎo)致的肝損傷,佐證了木犀草素的護(hù)肝作用。然而,木犀草素緩解甲基苯丙胺所致肝毒性的具體機(jī)制尚不得知。高通二代測(cè)序RNA-seq技術(shù)為挖掘可能的調(diào)控分子及通路提供了可能,故本實(shí)驗(yàn)利用RNA-seq研究木犀草素減緩METH所致肝毒性的分子機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目的:本研究擬通過建立METH動(dòng)物體內(nèi)肝毒性模型,在此基礎(chǔ)上檢測(cè)木犀草素對(duì)METH所致肝毒性的緩解作用,并運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),檢測(cè)木犀草素緩解METH肝毒性可能調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、潛在通路及可能分子機(jī)制,為進(jìn)一步研究木犀草素對(duì)METH所致肝毒性減輕作用的分子機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。方法:1.木犀草素減輕METH所致肝毒性動(dòng)物模型的建立選擇200g-220g SD雄性大鼠,設(shè)立對(duì)照組,METH組,木犀草素加METH組三組,對(duì)照組無(wú)處理,METH組,按照15mg/kg給藥,每12小時(shí)給藥一次,共8針,木犀草素+METH組,前3天木犀草素灌胃每次100mg/kg,每天一次連續(xù)三天,后給予METH處理,取肝臟組織固定,進(jìn)行HE染色,取血清并檢測(cè)血清中AST及ALT濃度。2.RNA-seq結(jié)果分析取建立模型中大鼠的肝臟組織,于-80℃保存,每組3個(gè)樣本,共三組分別是對(duì)照組,METH組,木犀草素加METH組三組,提取總RNA,質(zhì)檢后上機(jī)測(cè)序,初步結(jié)果進(jìn)行測(cè)序后相關(guān)分析。3.RNA-seq結(jié)果驗(yàn)證選取結(jié)果中的差異表達(dá)基因,進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)情況,驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性及可重復(fù)性。結(jié)果:1.木犀草素減輕METH所致肝毒性(1)組織病理學(xué)顯示,空白對(duì)照組肝臟組織完好,METH組肝臟組織可見彌漫性氣球樣變,木犀草素+METH組的程度介于空白對(duì)照組及METH組之間,其有較輕程度的細(xì)胞水腫樣改變。(2)生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè),血清中AST及ALT,空白對(duì)照組AST及ALT處于正常水平,METH組AST及ALT水平顯著升高,木犀草素+METH組血清中AST及ALT介于空白對(duì)照組及METH組之間,較METH組有明顯的下降。2.RNA-seq結(jié)果分析與對(duì)照組相比,在METH處理組中鑒定出1859個(gè)DGE,包括873個(gè)上調(diào)的和786個(gè)下調(diào)的DGE。同時(shí),在用木犀草素預(yù)處理的組中,與METH處理組相比,過濾了899個(gè)上調(diào)的和978個(gè)下調(diào)的DGE。最后,發(fā)現(xiàn)包括314個(gè)上調(diào)和183個(gè)下調(diào)DGE的497個(gè)DGE可能具有保護(hù)作用。并利用497個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析及KEGG分析得出,通過KEGG途徑分析富集了八個(gè)途徑,氧化磷酸化,非酒精性脂肪肝病(NAFLD),PPAR信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路主要是富集途徑。3.RNA-seq結(jié)果驗(yàn)證為了確認(rèn)mRNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,選擇6個(gè)基因以使用定量實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。與對(duì)照組相比,Leap2,Fasn,Fabp5和Pnpla3在METH組中是上調(diào)的DGE,并且Mbp和Calm3是在3組中沒有變化的基因。qRT-PCR的結(jié)果與mRNA測(cè)序的結(jié)果基本一致。結(jié)論:1.木犀草素能夠有效減輕由METH導(dǎo)致的肝毒性2.497個(gè)差異表達(dá)基因及8個(gè)信號(hào)通路可能參與到木犀草素緩解肝毒性作用中,根據(jù)此分析出可能的通路及潛在的機(jī)制。2.qRT-PCR的結(jié)果與mRNA測(cè)序的結(jié)果基本一致,提示RNA-Seq結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R99
【部分圖文】：

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本文編號(hào)：2833062