類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的慢性自身免疫病,滑膜組織為RA的主要炎癥靶點(diǎn),大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到滑膜組織,并產(chǎn)生多種致炎性細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-17等,最終導(dǎo)致成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)類腫瘤樣異常增生、遷移并獲得侵襲性。其中IL-6是非常重要的致炎細(xì)胞因子,IL-6水平的增高與疾病的活動(dòng)、發(fā)展以及治療效果都密切相關(guān),為細(xì)胞因子風(fēng)暴的重要誘導(dǎo)分子。IL-6信號(hào)激活誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞分化,產(chǎn)生IL-17,為另一個(gè)關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子,這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被稱為IL-6/IL-17炎性軸,在RA的病理機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。IL-6受體拮抗劑可有效改善RA臨床表現(xiàn),如關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)破壞,但可能誘發(fā)惡性感染、腫瘤等嚴(yán)重不良反應(yīng),限制了其臨床應(yīng)用,因此尋找阻止IL-6促進(jìn)IL-17等更多促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵分子靶點(diǎn),對(duì)于自身免疫病包括RA的治療具有重要意義。已知IL-6與IL-23、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)共同作用,依賴蛋白酪氨酸激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)信號(hào)通路,誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞向Th17分化。近期發(fā)現(xiàn),可誘導(dǎo)環(huán)磷腺苷早期阻抑蛋白(ICER)是Th17分化的必要分子,其由環(huán)磷酸腺苷(c AMP)-蛋白激酶A(PKA)-環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)信號(hào)通路產(chǎn)生,可促進(jìn)維甲酸相關(guān)孤兒核受體(RORγt)的累積。由于c AMP是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)特異性介導(dǎo)的下游信號(hào),在RA病程中,IL-6如何作用于GPCR信號(hào),調(diào)節(jié)c AMP-ICER,引起Th17的分化尚無(wú)報(bào)道。有研究顯示,腺苷抑制Th17細(xì)胞分化,在RA中,腺苷A3受體(A3AR)參與T細(xì)胞活化,A3AR為偶聯(lián)Gαi的GPCR,抑制c AMP-PKA信號(hào),IL-6引起的GPCR信號(hào)變化是否通過(guò)影響A3AR受體信號(hào)來(lái)發(fā)揮的尚不清楚。A3AR的活性主要受到G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(GRK2)的負(fù)性調(diào)節(jié),IL-6對(duì)GRK2有無(wú)調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。目前公認(rèn)的GRK2抑制劑為抗抑郁藥帕羅西汀,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)苯磺酰芍藥苷(CP-25)也具有GRK2活性抑制作用,并且可以顯著抑制關(guān)節(jié)炎癥,減少IL-17產(chǎn)生。因此本課題體外應(yīng)用IL-6、IL-23、TGF-β誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化,觀察IL-6對(duì)A3AR信號(hào)及其調(diào)節(jié)分子GRK2的影響;體內(nèi)用IL-6抑制劑和GRK2抑制劑治療CIA大鼠,觀察GRK2抑制劑對(duì)CIA大鼠Th17分化的影響,以進(jìn)一步闡明IL-6促進(jìn)Th17分化的分子機(jī)制及GRK2抑制劑改善大鼠CIA的作用機(jī)理,為進(jìn)一步揭示CIA的病理機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn),推動(dòng)CP-25這一自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)新藥的創(chuàng)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用磁珠分離純化Wistar大鼠CD3+T淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)觀察IL-6、TGF-β、IL-23共同刺激下Th17細(xì)胞的分化情況,GRK2及A3AR在T細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜表達(dá)的變化;體外應(yīng)用GRK2抑制劑帕羅西汀或A3AR激動(dòng)劑,觀察其對(duì)IL-6促Th17細(xì)胞分化功能的影響;并以Wistar大鼠建立CIA模型,分別給予IL-6受體(IL-6R)拮抗劑托珠單抗(TCZ)、注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白(rh TNFR:Fc)或甲氨蝶呤(MTX)治療14天,以及GRK2抑制劑帕羅西汀、CP-25或MTX治療14天,記錄大鼠整體指標(biāo)變化,包括全身評(píng)分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)和足爪腫脹度,胸腺和脾臟指數(shù),CCK-8法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞百分比和GRK2的分布情況,免疫熒光法檢測(cè)各組大鼠脾臟冰凍切片中A3AR的表達(dá)和分布情況。結(jié)果:1.IL-6體外刺激對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響。TGF-β和IL-23的基礎(chǔ)培養(yǎng)體系中加入IL-6,可顯著促進(jìn)T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。2.IL-6體外刺激對(duì)CD4+T細(xì)胞A3AR和GRK2胞質(zhì)胞膜表達(dá)的影響。IL-6/TGF-β/IL-23刺激與TGF-β/IL-23基礎(chǔ)刺激相比,A3AR在CD4+T細(xì)胞膜上的表達(dá)降低,在胞質(zhì)的表達(dá)明顯升高;GRK2在CD4+T細(xì)胞膜上的表達(dá)升高,在胞質(zhì)的表達(dá)降低。3.IL-6R拮抗劑對(duì)CIA大鼠整體指標(biāo)的影響。與正常大鼠相比,CIA大鼠出現(xiàn)全身評(píng)分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)炎腫脹數(shù)和足爪腫脹度的顯著升高,體重較正常組減輕,TCZ、rh TNFR:Fc和MTX可明顯改善CIA大鼠的各項(xiàng)臨床指標(biāo)。4.IL-6R拮抗劑對(duì)CIA大鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響。與正常大鼠相比,CIA大鼠的脾臟指數(shù)升高,胸腺指數(shù)降低,TCZ和MTX可顯著抑制CIA大鼠脾臟指數(shù),TCZ、rh TNFR:Fc和MTX可顯著恢復(fù)CIA大鼠的胸腺指數(shù)。5.IL-6R拮抗劑對(duì)CIA大鼠胸腺T細(xì)胞活力的影響。CCK-8檢測(cè)顯示,CIA組大鼠胸腺T細(xì)胞活力明顯增強(qiáng),TCZ、rh TNFR:Fc和MTX體內(nèi)給藥明顯降低CIA大鼠胸腺T淋巴細(xì)胞活力。6.IL-6R拮抗劑對(duì)CIA大鼠脾臟Th17細(xì)胞比例的影響。CIA大鼠脾臟Th17細(xì)胞比例明顯升高,TCZ和MTX體內(nèi)給藥顯著降低CIA大鼠脾臟Th17細(xì)胞比例,rh TNFR:Fc組Th17細(xì)胞比例輕度降低,但沒有顯著性差異。7.IL-6R拮抗劑對(duì)CIA大鼠脾臟GRK2在CD4+T胞質(zhì)胞膜表達(dá)的影響。CIA大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞胞膜上GRK2表達(dá)明顯升高,TCZ和MTX體內(nèi)給藥明顯降低GRK2在大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞胞膜上的表達(dá),rh TNFR:Fc給藥對(duì)其沒有明顯影響;GRK2在各組大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)的表達(dá)水平無(wú)顯著性變化。8.IL-6R拮抗劑對(duì)Th17細(xì)胞中A3AR在胞質(zhì)的分布情況的影響。脾臟冰凍切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,CIA大鼠脾組織中Th17細(xì)胞的比例明顯升高,TCZ、rh TNFR:Fc和MTX可降低CIA大鼠脾臟Th17細(xì)胞的比例;脾臟組織A3AR的表達(dá)水平各組間無(wú)顯著性差異;CIA大鼠脾組織中IL-17與A3AR的共定位增多,TCZ、rh TNFR:Fc和MTX體內(nèi)給藥明顯減少脾組織中IL-17與A3AR的共定位。9.A3AR激動(dòng)劑IB-MECA體外給藥對(duì)IL-6誘導(dǎo)的Th17分化的影響。IL-6/TGF-β/IL-23體外刺激可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化,同時(shí)給予A3AR激動(dòng)劑IB-MECA可阻止Th17細(xì)胞的分化。10.帕羅西汀體外給藥對(duì)IL-6誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞GRK2和A3AR胞質(zhì)胞膜表達(dá)的影響。與基礎(chǔ)刺激組相比,IL-6可降低A3AR在CD4+T細(xì)胞胞膜的表達(dá),增加其在胞質(zhì)的分布;與IL-6刺激組相比,同時(shí)給予帕羅西汀可顯著恢復(fù)A3AR在胞膜的表達(dá),減少A3AR在胞質(zhì)的表達(dá);與基礎(chǔ)刺激組相比,IL-6可升高GRK2在CD4+T細(xì)胞胞膜的表達(dá),減少GRK2在胞質(zhì)的表達(dá);與IL-6刺激組相比,同時(shí)給予帕羅西汀可降低GRK2的胞膜分布,升高GRK2在胞質(zhì)的表達(dá)。11.帕羅西汀體外給藥對(duì)IL-6誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化的影響。與基礎(chǔ)刺激組相比,IL-6可顯著促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化,GRK2抑制劑帕羅西汀可明顯減弱IL-6/TGF-β/IL-23對(duì)Th17細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用。12.GRK2抑制劑對(duì)CIA大鼠整體指標(biāo)的影響。與正常組相比,CIA大鼠全身評(píng)分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)炎腫脹數(shù)和足爪腫脹度顯著升高,體重較正常組減輕,帕羅西汀、CP-25和MTX可有效改善CIA大鼠的上述臨床指標(biāo)。13.GRK2抑制劑對(duì)于CIA大鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響。與正常大鼠相比,CIA大鼠的脾臟指數(shù)升高,胸腺指數(shù)降低,帕羅西汀、CP-25和MTX體內(nèi)給藥可顯著降低CIA大鼠脾臟指數(shù),CP-25和MTX可明顯恢復(fù)CIA大鼠的胸腺指數(shù)。14.GRK2抑制劑對(duì)CIA大鼠脾臟Th17細(xì)胞比例的影響。CIA大鼠脾臟Th17細(xì)胞比例明顯升高,帕羅西汀、CP-25和MTX體內(nèi)給藥體內(nèi)給藥顯著降低CIA大鼠脾臟Th17細(xì)胞比例。15.GRK2抑制劑對(duì)CIA大鼠脾臟GRK2在CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)胞膜表達(dá)的影響。CIA大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞胞膜GRK2表達(dá)明顯升高,帕羅西汀、CP-25和MTX體內(nèi)給藥明顯降低GRK2在大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞胞膜上的表達(dá);各組大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)的GRK2分布無(wú)顯著差異。16.GRK2抑制劑對(duì)Th17細(xì)胞中A3AR在胞質(zhì)的分布情況的影響。脾臟冰凍切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,CIA大鼠脾臟中Th17細(xì)胞的比例明顯升高,帕羅西汀、CP-25和MTX可顯著降低CIA大鼠脾臟Th17細(xì)胞的比例;各組大鼠脾臟組織A3AR的表達(dá)水平無(wú)顯著變化;CIA大鼠脾臟細(xì)胞中IL-17與A3AR的共定位增強(qiáng),帕羅西汀、CP-25和MTX體內(nèi)給藥可明顯降低脾臟IL-17與A3AR的共定位。結(jié)論:1.IL-6升高CD4+T細(xì)胞胞膜上GRK2表達(dá),促進(jìn)A3AR內(nèi)吞,抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),是其誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的重要機(jī)制之一。2.抑制GRK2活性可減少炎癥狀態(tài)下Th17細(xì)胞的分化,是CP-25改善大鼠CIA的重要作用機(jī)理。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文Th 細(xì)胞表達(dá) IL-23 受體（IL-23 receptor, IL-23R），使 Th 細(xì)胞對(duì) IL-23 的反應(yīng)增強(qiáng)，IL-23 可維持 Th17 細(xì)胞的穩(wěn)定并促進(jìn)其產(chǎn)生 Il-17，發(fā)揮致炎作用[27]。因此在本實(shí)驗(yàn)中，于 96 孔板每孔加入 1×106個(gè)分離純化的脾臟 T 淋巴細(xì)胞。IL-6 組每孔加入IL-6 40 ng/ml、TGF-β 3 ng/ml 和 IL-23 30 ng/ml，誘導(dǎo) Th17 細(xì)胞分化；Control 組每孔加入 TGF-β 3 ng/ml 和 IL-23 30 ng/ml。72 h 后標(biāo)記 CD4 和 IL-17A，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示 Control 組 Th17 細(xì)胞比例平均為 0.705%，IL-6 組 Th17 細(xì)胞比例平均為 1.432%，提示 IL-6 體外刺激可顯著升高 Th17 細(xì)胞的分化比例（圖1C 和 D）。

圖 2. IL-6 體外刺激對(duì) CD4+T 細(xì)胞 A3AR 和 GRK2 胞質(zhì)胞膜表達(dá)的影響（n=3, 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）。 （A）IL-6 刺激組與 control 組胞膜 A3AR 表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析圖。與只給予了 TGF-β和 IL-23 的對(duì)照組細(xì)胞相比，IL-6 體外刺激可降低胞膜 A3AR 表達(dá)；（B）IL-6 刺激組與 control 組胞質(zhì) A3AR 表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析圖。與 Control 組細(xì)胞相比，IL-6 體外刺激可顯著升高胞質(zhì) A3AR 表達(dá)；（C）IL-6 刺激組與 control 組胞膜 GRK2表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析圖。與 Control 組細(xì)胞相比，IL-6 體外刺激可升高胞膜 GRK2 表達(dá)；（D）IL-6 刺激組與 control 組胞質(zhì) GRK2 表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析圖。與 Control 組細(xì)胞相比，IL-6 體外刺激可降低胞質(zhì) GRK2 表達(dá)。Fig 2. Effect of IL-6 in vitro stimulation on the expression and distribution ofA3AR and GRK2 in CD4+T cells. Comparing with the control group, the expressionof A3AR on the plasma membrane was decreased in CD4+T cells, and was increased inthe cytoplasm with IL-6 stimulation (A, B). Plasma membrane GRK2 expression was

27圖 3. IL-6R 拮抗劑對(duì)于 CIA 大鼠整體指標(biāo)的影響（n=6, 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）。（A）與正常組大鼠相比，CIA 大鼠全身評(píng)分顯著升高，TCZ 和 rhTNFR:Fc 尾靜脈注射、MTX 灌胃給藥可顯著改善 CIA 大鼠的全身評(píng)分； （B）與正常組大鼠相比，CIA大鼠體重隨病程的發(fā)展明顯降低，TCZ 和 rhTNFR:Fc 尾靜脈注射、MTX 灌胃給藥可顯著升高 CIA 大鼠體重；（C）與正常組大鼠相比，CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈上升趨勢(shì)，TCZ 和 rhTNFR:Fc 尾靜脈注射、MTX 灌胃給藥可顯著改善 CIA 大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)；（D）與正常組大鼠相比，CIA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)呈上升趨勢(shì)，TCZ 和

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