目的病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是由柯薩奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)感染引發(fā)的機(jī)體免疫反應(yīng),主要發(fā)病于青少年和兒童,常表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤,進(jìn)一步發(fā)展為慢性心肌病、擴(kuò)張型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)和充血性心衰,嚴(yán)重的可導(dǎo)致急性心力衰竭甚至引發(fā)猝死。然而,目前VMC的發(fā)病機(jī)理仍不清晰,尚且缺乏高效精準(zhǔn)的治療方法及安全有效的治療藥物,因此,探索病毒性心肌炎癥的發(fā)病機(jī)制,為臨床尋找安全、有效的治療藥物極其重要。FNC是一種新型的核苷類似物,前期的研究表明其具有非常明顯的抗艾滋病毒(HIV)以及抗乙型肝炎病毒(HBV)功效,但關(guān)于其抗柯薩奇病毒B3的研究未見報道。因此,本課題通過建立病毒性心肌炎體外細(xì)胞模型以及體內(nèi)動物模型,探索FNC的抗CVB3活性以及對心肌損傷、炎性浸潤的治療作用,為尋找高效低毒的抗病毒藥物提供理論依據(jù)。方法1體外研究1.1藥效實(shí)驗采用終點(diǎn)稀釋法測定本實(shí)驗所用CVB3的滴度TCID_(50),選取合適的病毒感染量;通過CVB3感染生長狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞,建立VMC細(xì)胞模型;采用MTT法及三種不同的給藥方法,檢測FNC體外抗CVB3活性及作用方式。1.2機(jī)制研究根據(jù)FNC的有效劑量,通過RT-PCR法,檢測FNC體外對病毒、免疫應(yīng)答及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響;通過Western Blot法檢測FNC對NF-κB蛋白表達(dá)的影響。2體內(nèi)研究2.1藥效實(shí)驗通過雄性Balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒稀釋液,建立VMC動物模型,連續(xù)灌胃給藥一周,觀察小鼠狀態(tài)、記錄體重變化;摘眼球取血,采用ELISA法測定各組小鼠血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性的變化;進(jìn)行小鼠心肌組織病理學(xué)檢查,評價FNC對VMC小鼠心肌的保護(hù)作用。2.2機(jī)制研究通過RT-PCR法檢測FNC對病毒基因在小鼠心臟、胰腺以及肝臟中表達(dá)水平的影響;采用ELISA法檢測FNC對血清中炎癥因子IL-4,IL-6和TNF-α分泌的影響。結(jié)果1體外研究1.1藥效實(shí)驗結(jié)果CVB3滴度TCID_(50)為10~(-7.8)。FNC對Hela細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC_(50)為858.517±44.099μg/ml,對CVB3病毒的半數(shù)抑制濃度IC_(50)為1.834±1.711 ng/ml,治療指數(shù)TI為4.681×10~5;陽性對照藥物利巴韋林的TC_(50)值為209.117±46.042μg/m,IC_(50)為7.343±3.028μg/ml,TI為28.478。結(jié)果表明,FNC可以通過預(yù)防、治療以及直接作用病毒三種方式發(fā)揮很好的抗CVB3活性,其中治療法效果最好。1.2機(jī)制研究結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示,基因水平上,FNC對CVB3病毒衣殼基因VP-1的表達(dá)具有明顯抑制作用,同時下調(diào)固有免疫反應(yīng)相關(guān)基因TLR3、TLR7、RIG-1、MDA-5、NF-κB以及炎癥相關(guān)基因IL-4、IL-6、TNF-α的表達(dá)(P0.05);Western Blot實(shí)驗表明,在蛋白水平上,病毒感染后細(xì)胞中的NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào),而FNC能夠有效抑制其表達(dá),發(fā)揮抗炎癥作用(P0.05)。2體內(nèi)研究2.1藥效實(shí)驗結(jié)果成功構(gòu)建VMC小鼠模型,結(jié)果顯示,FNC可有效緩解病毒性心肌炎癥狀,降低血清心肌酶活性。另外,病理組織切片結(jié)果也直觀表明FNC可抑制心肌壞死及炎性浸潤,對病毒性心肌炎有很好的治療作用。2.2機(jī)制研究結(jié)果FNC不僅有效抑制心肌炎小鼠心臟、胰腺、肝臟中的CVB3病毒的復(fù)制,而且能抑制血清中炎癥因子IL-4,IL-6和TNF-α的表達(dá),同時發(fā)揮抗病毒、抗炎癥的作用(P0.05)。結(jié)論1.FNC在體內(nèi)、體外皆具有顯著的抗CVB3活性。2.FNC發(fā)揮抗CVB3活性的機(jī)制可能與抑制病毒復(fù)制及炎癥反應(yīng)有關(guān)。3.FNC抑制病毒復(fù)制的方式主要為進(jìn)入細(xì)胞,抑制病毒的生物合成。4.FNC可能通過下調(diào)固有免疫識別受體的表達(dá),抑制NF-κB信號通路,減少炎癥因子分泌,降低炎癥損傷。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【文章目錄】：
摘要
abstract
引言
第一部分 FNC體外抗柯薩奇病毒B3活性及機(jī)制研究
    1 材料與儀器
        1.1 實(shí)驗細(xì)胞
        1.2 實(shí)驗病毒
        1.3 實(shí)驗藥物
        1.4 主要試劑
        1.5 主要儀器
        1.6 溶液配置
    2 實(shí)驗方法
        2.1 FNC體外抗CVB3藥效學(xué)實(shí)驗
            2.1.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存
            2.1.2 FNC對Hela細(xì)胞的毒性測定
            2.1.3 CVB3病毒擴(kuò)增
            2.1.4 CVB3滴度測定
            2.1.5 FNC體外抗CVB3活性實(shí)驗
            2.1.6 三種作用方式檢測FNC體外抗CVB3活性
        2.2 FNC體外抗CVB3機(jī)制的初步探索
            2.2.1 FNC體外抗CVB3對病毒、免疫及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響
                2.2.1.1 引物設(shè)計與合成
                2.2.1.2 細(xì)胞中總RNA的提取
                2.2.1.3 RNA提取質(zhì)量檢測
                    2.2.1.3.1 RNA純度檢測
                    2.2.1.3.2 RNA完整性檢測
                2.2.1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄
                2.2.1.5 RT-PCR反應(yīng)
            2.2.2 FNC對CVB3感染的Hela細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的影響
                2.2.2.1 細(xì)胞總蛋白的提取
                2.2.2.2 BCA法測定蛋白濃度
                2.2.2.3 制備聚丙烯酰胺凝膠
                2.2.2.4 上樣及電泳
                2.2.2.5 轉(zhuǎn)膜
                2.2.2.6 封閉
                2.2.2.7 孵育一抗
                2.2.2.8 孵育二抗
                2.2.2.9 成像
    3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4 實(shí)驗結(jié)果
        4.1 FNC體外抗CVB3藥效實(shí)驗結(jié)果
            4.1.1 FNC對Hela細(xì)胞毒性結(jié)果
            4.1.2 CVB3的病毒滴度結(jié)果
            4.1.3 FNC體外抗CVB3活性結(jié)果
            4.1.4 FNC體外對CVB3的作用方式
        4.2 FNC體外抗CVB3機(jī)制研究結(jié)果
            4.2.1 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果
            4.2.2 FNC體外抗CVB3對病毒、免疫及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果
            4.2.3 FNC對CVB3感染的Hela細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的影響結(jié)果
    5 討論
    6 小結(jié)
第二部分 FNC體內(nèi)抗柯薩奇病毒B3活性及機(jī)制研究
    1 材料與儀器
        1.1 實(shí)驗病毒
        1.2 實(shí)驗動物
        1.3 實(shí)驗藥物
        1.4 主要試劑
        1.5 主要儀器
    2 實(shí)驗方法
        2.1 FNC體內(nèi)抗CVB3藥效學(xué)實(shí)驗
            2.1.1 建立病VMC小鼠模型
            2.1.2 動物處理
            2.1.3 血清酶活檢測
            2.1.4 心臟病理組織檢測
        2.2 FNC體內(nèi)抗CVB3機(jī)制的研究
            2.2.1 RT-PCR法檢測小鼠臟器中CVB3基因的表達(dá)
                2.2.1.1 引物設(shè)計與合成
                2.2.1.2 組織中總RNA的提取
                2.2.1.3 反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR反應(yīng)
            2.2.2 血清炎癥因子的檢測
    3 統(tǒng)計學(xué)分析
    4 實(shí)驗結(jié)果
        4.1 FNC體內(nèi)抗CVB3的藥效學(xué)實(shí)驗結(jié)果
            4.1.1 接種CVB3病毒對Balb/c小鼠狀態(tài)的影響
            4.1.2 FNC對VMC小鼠血清酶活影響
            4.1.3 心臟病理學(xué)檢測結(jié)果
        4.2 FNC體內(nèi)抗CVB3機(jī)制研究結(jié)果
            4.2.1 FNC對VMC小鼠臟器中CVB3基因的影響結(jié)果
            4.2.2 FNC對VMC小鼠血清中炎癥因子的影響
    5 討論
    6 小結(jié)
全文結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
個人簡介
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2831755