本文運(yùn)用MDC、DAPI染色、RNA干擾、熒光標(biāo)記、Western Blot分析等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)和方法,以C2C12和L6細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,綜合研究了馬度霉素誘導(dǎo)骨骼肌凋亡與自噬流阻斷的關(guān)系,較為深入解析了 Akt信號在馬度霉素誘導(dǎo)自噬流阻斷導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)理。結(jié)果如下:1馬度霉素誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞自噬體積累和自噬流阻斷C2C12和L6細(xì)胞或感染Ad-GFP-LC3的C2C12和L6細(xì)胞,用0、0.05、0.1、0.2、0.5、1 μM馬度霉素處理24 h后,MDC染色分析熒光強(qiáng)度,Western blot分析LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá),熒光拍照和定量統(tǒng)計(jì)GFP-LC3 puncta變化;使用重組腺病毒表達(dá)串聯(lián) m-Cherry-GFP-LC3(Ad-mCherry-GFP-LC3)感染 C2C12和L6細(xì)胞分析馬度霉素(0、0.5、1μM)誘導(dǎo)自噬流表現(xiàn)。結(jié)果顯示:馬度霉素引起C2C12和L6細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度增強(qiáng),GFP-LC3puncta增多;馬度霉素以濃度依賴的方式引起LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)升高;馬度霉素可以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)更多mCherry和GFP-LC3共定位。提示:馬度霉素誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞自噬體積累和自噬流阻斷。2馬度霉素阻斷骨骼肌細(xì)胞自噬流引發(fā)凋亡使用自噬抑制劑CQ和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素分析馬度霉素誘導(dǎo)自噬體積累和自噬流阻斷在凋亡中的作用。結(jié)果顯示,CQ強(qiáng)化馬度霉素誘導(dǎo)自噬流阻斷致細(xì)胞凋亡增加,雷帕霉素改善馬度霉素誘導(dǎo)自噬流阻斷,進(jìn)而保護(hù)骨骼肌細(xì)胞抗凋亡。提示:馬度霉素阻斷骨骼肌細(xì)胞自噬流引發(fā)凋亡。3馬度霉素抑制Akt介導(dǎo)自噬流阻斷致骨骼肌細(xì)胞凋亡采用Western Blot分析馬度霉素處理骨骼肌細(xì)胞的Akt和GSK3β磷酸化變化;Akt抑制劑抑制Akt活性以及腺病毒持續(xù)激活A(yù)kt(Ad-myr-Akt)活性,觀察細(xì)胞GFP-LC3 puncta數(shù)量、細(xì)胞活性、自噬流及凋亡表現(xiàn)。結(jié)果顯示:馬度霉素抑制Akt和GSK3β磷酸化;Akt抑制劑強(qiáng)化馬度霉素誘導(dǎo)GFP-LC3 puncta增加及細(xì)胞活性降低和凋亡增加,且LC3-Ⅱ和p62、Cleaved-caspase-3表達(dá)也進(jìn)一步增強(qiáng);持續(xù)激活A(yù)kt削弱馬度霉素誘導(dǎo)以上事件。提示:馬度霉素抑制Akt介導(dǎo)自噬流阻斷致骨骼肌細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R99
【部分圖文】：

將包裹物完全與外界隔離形成雙層膜細(xì)胞器自噬體，自噬體攜帶貨物運(yùn)輸?shù)饺苊稿义象w并與之融合，最后溶酶體發(fā)揮降解功能并釋放最終產(chǎn)物氨基酸等供細(xì)胞重新利逡逑用［１（）］。研究者將此動態(tài)過程稱為自噬流（Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ邋ｆｌｕｘ）邋［１１］，圖２－１為自噬流逡逑Ｐｌａｓｍａ逡逑＾邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑ｚ邐Ｌｙｓｏｓｏｍｅ邋Ｔ邋Ｔ逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋１逡逑Ｃ＇＼0Ｃ＾邐Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｎｏｍｉａｌ邋ｆｌｕｘ邐、0逡逑＾邋0邐‘邐Ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｃ逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑圖２－１自噬流通暢［１２］逡逑＾Ｐｌａｓｍａ＾＇＇＇＇＇逡逑Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｂｌｏｃｋ邋ｉｎ邋ｆｌｕｘ邋ｍｅｍ＾ｒａｎ＾邋＿＾逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ邐／＼逡逑Ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ逡逑Ｉｄ＃擺邋Ｉ逡逑圖２－２自噬流阻斷［１２］逡逑

將包裹物完全與外界隔離形成雙層膜細(xì)胞器自噬體，自噬體攜帶貨物運(yùn)輸?shù)饺苊稿义象w并與之融合，最后溶酶體發(fā)揮降解功能并釋放最終產(chǎn)物氨基酸等供細(xì)胞重新利逡逑用［１（）］。研究者將此動態(tài)過程稱為自噬流（Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ邋ｆｌｕｘ）邋［１１］，圖２－１為自噬流逡逑Ｐｌａｓｍａ逡逑＾邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑ｚ邐Ｌｙｓｏｓｏｍｅ邋Ｔ邋Ｔ逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋１逡逑Ｃ＇＼0Ｃ＾邐Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｎｏｍｉａｌ邋ｆｌｕｘ邐、0逡逑＾邋0邐‘邐Ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｃ逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑圖２－１自噬流通暢［１２］逡逑＾Ｐｌａｓｍａ＾＇＇＇＇＇逡逑Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｂｌｏｃｋ邋ｉｎ邋ｆｌｕｘ邋ｍｅｍ＾ｒａｎ＾邋＿＾逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ邐／＼逡逑Ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ逡逑Ｉｄ＃擺邋Ｉ逡逑圖２－２自噬流阻斷［１２］逡逑

源性還是外源性的凋亡刺激因素都會導(dǎo)致Ｃａｓｐａｓｅ介導(dǎo)的Ｂｅｃｌｉｎ邋１裂解，裂解后逡逑的Ｂｅｃｌｉｎｌ會定位至線粒體，加重細(xì)胞凋亡，此外ｐ５３、ＤＡＰＡ、ｍＴＯＲ都是自噬逡逑與凋亡的交叉作用的信號途徑，具體如圖２－３所示［４３］。逡逑３聚醚類離子載體抗生素與自噬逡逑常見的聚醚類離子載體抗生素主要有馬度霉素、莫能菌素以及鹽霉素。關(guān)于逡逑馬度霉素與自噬的報(bào)道寥寥無幾，己有研究發(fā)現(xiàn)馬度霉素通過阻斷自噬流誘導(dǎo)心逡逑肌細(xì)胞發(fā)生死亡［４４］，而關(guān)于莫能菌素與自噻的報(bào)道也是屈指可數(shù)，關(guān)于莫能菌素逡逑與自嗤的報(bào)道是在１９８６年，研宄者Ｒｏｇａｎ等在細(xì)粒棘球絳蟲的原核細(xì)胞觀察到逡逑莫能菌素引起的自噬［４５］，隨后在２０１２年在弓形蟲中發(fā)現(xiàn)自噬作為莫能菌素的死逡逑亡誘導(dǎo)機(jī)制［４６］，２０１３年發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞中莫能菌素誘導(dǎo)的自噬抑制能夠增強(qiáng)細(xì)胞逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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1 薄海波;雒麗麗;曹彥忠;星玉秀;龐國芳;;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶和奶粉中6種聚醚類抗生素殘留量[J];分析化學(xué);2009年08期

2 沈建忠,錢傳范,江海洋,劉金鳳;馬杜霉素在雞組織中殘留消除及臨床毒性的研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2000年05期

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1 陳新;馬度米星銨致H9c2心肌細(xì)胞和C2C12骨骼肌細(xì)胞毒性作用機(jī)制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2830651