多烯紫杉醇(DTX)是第二代紫杉烷類抗腫瘤藥,其作為原發(fā)肺癌治療的一線或二線臨床用藥,具有確切的療效,但對于臨床上高發(fā)的肺癌骨轉(zhuǎn)移療效差且毒副作用大,主要原因是多烯紫杉醇對骨上轉(zhuǎn)移的肺癌腫瘤細胞的靶向性差,達不到足夠的治療劑量。為了解決這個瓶頸問題,本研究首先采用了腫瘤血管靶向的二十二碳六烯酸(DHA)偶聯(lián)的牛血清白蛋白(BSA)作為載體(DHA-BSA)包載藥物來增強藥物的腫瘤靶向性。其次考慮到DHA-BSA包載的多烯紫杉醇緩釋造成的毒性不可耐受,利用氧化還原雙敏感的單硫醚鍵作為化學連接臂設計了多烯紫杉醇前藥(DTX-S-DTX),基于腫瘤組織內(nèi)存在高氧化還原微環(huán)境,實現(xiàn)多烯紫杉醇的腫瘤組織的控釋給藥。最后采用乳化法將前藥與載體制備成納米粒(DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs)。本研究構建了腫瘤微環(huán)境響應的多烯紫杉醇前藥治療肺癌骨轉(zhuǎn)移的腫瘤靶向遞送系統(tǒng),并對該體系進行評價,所得研究結果如下:1.DTX-S-DTX前藥的合成:以單硫醚鍵作為氧化還原敏感的化學連接臂設計了DTX-S-DTX前藥,再利用質(zhì)譜及核磁共振氫譜等手段,確定了 DTX-S-DTX合成成功。2.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的制備及優(yōu)化:首先選擇DHA上的羧基和牛血白蛋白的氨基通過混合酸酐法進行酰胺化反應,得到DHA偶聯(lián)的牛血白蛋白作為腫瘤血管靶向的載體。制備DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs采用單因素實驗優(yōu)化其制備條件,優(yōu)化結果為偶聯(lián)蛋白(DHA-BSA)濃度5 mg/mL、有機相與水相的體積比1:16、勻漿轉(zhuǎn)速6000 rpm、勻漿時間6 min、均質(zhì)壓力800 bar、均質(zhì)次數(shù)7次。在此優(yōu)化條件下,制備的 DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 的粒徑 98.8±11.7 nm,電位-20.901±1.24 mV,載藥量7.86%±1.4%,包封率 84.6%±4.3%,DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 中 DHA 含量為4.04%土1.2%,n=3。3.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 的表征:①掃描電子顯微鏡形態(tài)學觀察:DTX-S-DTX呈現(xiàn)不均勻長片狀,并且粒徑大小為微米級;DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs呈現(xiàn)近似球形,粒徑大小在100 nm左右。②X 射線衍射檢測:DTX-S-DTX 在 10.71°、12.15°、13.57°、17.14°和 19.29°等處出現(xiàn)了大量衍射峰,且峰強度大;DTX-S-DTX與DHA-BSA的物理混合物在19.27°和31.66°處出現(xiàn)兩個衍射峰,且峰強度明顯變小;DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs在19.28。處出現(xiàn)一個衍射峰,且峰強度明顯變小。表明DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs結晶度減小,DTX-S-DTX以無定型形態(tài)存在于納米粒中,所以DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs表現(xiàn)出較好的水溶性。③熱差分析檢測:DTX-S-DTX原藥在216.07℃時出現(xiàn)一個較強的熱吸收峰,表明其是晶體狀態(tài),而DTX-S-DTX與DHA-BSA的物理混合物在216.07℃時熱吸收峰十分微弱,表明有少量DTX-S-DTX晶體被DHA-BSA的表面吸附,DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 在 216.07°C熱吸收峰消失,表明在 DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 中的 DTX-S-DTX以無定形態(tài)存在。4.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 的復溶穩(wěn)定性實驗:凍干的 DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs復溶于去離子水后在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時間點分別測定其粒徑和電位,結果分別為 97.4±15.3 nm和-20.90±1.63 mV、101.0±14.8 nm 和-21.37 土1.83 mV、104.2±15.9 nm 和-21.56±1.36 mV、110.3±15.9 nm 和-20.76±0.92 mV、122.0±17.1 nm 和-19.33±1.88 mV、129.1±16.6 nm 和-19.92±1.43 mV、146.0±18.1 nm和-19.86±1.47 mV,其粒徑和電位值在8 h內(nèi)未出現(xiàn)較大變化且均在220 nm以下,表明其穩(wěn)定性較好。5.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的體外釋放實驗:將含30%乙醇的PBS緩沖液(pH=7.4)作為釋放介質(zhì),考察了 DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs在添加過氧化氫(H2O2)或二硫蘇糖醇(DTT)條件下釋放DTX的釋放情況。結果表明,在不添加過氧化氫(H2O2)或二硫蘇糖醇(DTT)的釋放介質(zhì)中,12 h內(nèi)有10.4%±2.4%DTX從納米粒中釋放出來。而添加5 mM H2O2、10 mM H2O2、5 mM DTT、10 mM DTT的4種釋放介質(zhì)中,12 h 內(nèi)分別有 88.1%±8.7%、91.3%±8.1%、34.7%±5.2%、41.6%±3.8%的DTX從DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs中釋放出來,這說明設計的DTX-S-DTX前藥能在氧化還原環(huán)境中快速釋放DTX。6.DTX-S-DTX和DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的急毒性實驗:采用昆明小鼠建立模型,分別以 5 μmoL/kg、10 μmoL/kg、15 μmoL/kg、20 moL/kg 和 25μmoL/kg 劑量的DTX-S-DTX和DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs給藥,并觀察小鼠的生存狀態(tài)、記錄小鼠體重。實驗結果表明,DTX-S-DTX的最大耐藥劑量為5 μmoL/kg,DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的最大耐藥劑量為10μmoL/kg。7.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs體內(nèi)抗腫瘤活性研究:采用C57BL/6小鼠建立肺癌骨轉(zhuǎn)移模型,研究DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的抑制肺癌骨轉(zhuǎn)移活性,空白對照組的平均生存期為19.86±2.96 d,5 μmoL/kg DTX組的平均生存期為25.43±1.38 d,2.5μmoL/kg DTX-S-DTX 組的平均生存期為 26.71±1.34 d(P0.05),2.5 μmoL/kg DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 組的平均生存期為 29.29±2.37 d(P0.01),5 μmoL/kg DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs組的平均生存期為33.00±2.55 d(P0.01)�？狗伟┕寝D(zhuǎn)移活性研究中,空白對照組的平均體重為26.08±1.67 g,5 μmoL/kg DTX組的平均體重為24.45±1.89 g,2.5 μmoL/kg DTX-S-DTX 組的平均體重為 24.30 土 1.88 g,2.5 μmoL/kg DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 組的平均體重為 26.39±2.30 g,5μmoL/kg DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs組的平均體重為26.98±2.43 g。以上數(shù)據(jù)表明DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs比DTX或DTX-S-DTX對肺癌骨轉(zhuǎn)移具有更強的抑制作用,提高了小鼠的平均生存時間,同時降低了藥物的非腫瘤組織毒性。本文制備的DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs具有較好的的水溶性、復溶穩(wěn)定性、腫瘤靶向性、腫瘤組織釋藥可控性和較低的毒副作用,從而也具有了較強的抗肺癌骨轉(zhuǎn)移作用,具有了進一步開發(fā)為抗肺癌骨轉(zhuǎn)移藥物的潛在價值。本研究將為肺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤靶向輸送系統(tǒng)設計提供新思路,為臨床上突破肺癌骨轉(zhuǎn)移治療瓶頸打下堅實理論與實踐基礎。
【學位單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R943;R96
【部分圖文】：

脂肪酸對于腫瘤細胞也就形成了邋“營養(yǎng)靶向”的作用［１（）３］。正因如此有人設計了紫杉醇－不逡逑飽和脂肪酸前藥來解決因大量使用輔料帶來的不良反應以及增加藥物的靶向性［１（）４１。比逡逑如紫杉醇－二十二碳六烯酸前藥（ＰＴＸ－ＤＨＡ．化學結構見圖１－３）已經(jīng)進入臨床試驗ＩＩＩ期逡逑［１Ｑ５，＿。此外，還有反油酸－阿糖胞苷前藥ｌｌＧ３１邋（ＣＰ－４０５５），己經(jīng)進入臨床ＩＩＩ期、反油酸－逡逑吉西他濱前藥（ＣＰ－４１２６），能夠進入臨床ＩＩ期�？偠灾�，不飽和脂肪酸－抗腫瘤藥逡逑物前藥的優(yōu)點在于ｌｌＣ）３］：邋（１）將兩者相連有利于增強抗腫瘤藥物的穩(wěn)定性，防止藥物被逡逑清除（２）增強了極性藥物的脂溶性，有助于其跨膜運輸（３）由于快速生長的腫瘤細胞逡逑對營養(yǎng)物質(zhì)需求更大，借此可以實現(xiàn)不飽和脂肪酸的腫瘤＂營養(yǎng)靶向”藥物傳遞；（４）逡逑增強部分抗腫瘤藥物的化療敏感性（５）利用前藥原理，降低抗腫瘤藥物的毒副作用。逡逑ＡｃＣ＼邋Ｐ邋ＯＨ逡逑Ｉ邋ｘＭＡ逡逑Ｐｈ＾＾ＮＨ邋0邋／逡逑

邐東北林業(yè)大學碩士學位論文邐逡逑子結構均易發(fā)生裂解，形成一些質(zhì)譜碎片峰［１１９］。由于ＤＴＸ－Ｓ－ＤＴＸ邋（Ｍ）中Ｃ－Ｓ鍵極易逡逑斷裂形成Ｍｉ：邋ｍ／ｚ邋８４８．３５３４和Ｍ２：邋ｍ／ｚ邋８８１．５４４５，通過對圖２－３中碎片峰的解析，符合目逡逑標產(chǎn)物ＤＴＸ－Ｓ－ＤＴＸ的裂解特點。解析結果見表２－３。逡逑

３．７結果與討論逡逑３Ｊ．１紅外光譜測定結果逡逑ＢＳＡ、ＤＨＡ和ＤＨＡ－ＢＳＡ三者的紅外光譜圖的對比結果如圖３－１所示：ＢＳＡ的紅逡逑外光譜圖中，在３５００？３１００邋ｃｎｆ１處有吸收峰，即５號峰，是Ｎ－Ｈ伸縮振動峰；在１６５３．５逡逑ｃｍ＇１和１５３１邋ｃｎＴ１處有兩個明顯的吸收峰，如圖２、３號峰所示。ＤＨＡ的紅外光譜圖逡逑中，在３００８邋ｃｍ＿１為不飽和＝Ｃ－Ｈ伸展運動的吸收，如４號峰所示；１０００？１５００ｃｍ＿１處有－逡逑ＣＨ２－、－ＣＨ３－彎曲振動和Ｃ＝０伸展振動，是結構中有酯的特征吸收，如圖中１處峰。逡逑ＤＨＡ－ＢＳＡ中出現(xiàn)酰胺鍵的強特征吸收峰增強如圖中６號峰所示

【參考文獻】

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本文編號：2829624