中國是世界第一肝炎大國,且乙肝病毒感染引起的肝衰竭是我國最常見的肝臟疾病死亡原因。在西方國家,過量服用對乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是導(dǎo)致急性肝衰竭的最主要原因。目前臨床上對肝炎,尤其是肝衰竭仍缺乏有效的治療藥物,因此開展高效低毒的肝炎/肝衰竭治療新藥的研發(fā)具有重要的實用價值和社會意義。鑒于細胞死亡在幾乎所有類型的肝臟疾病中具有決定性作用,目前靶向凋亡和壞死性凋亡成為治療肝病的研究方向之一。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是人體內(nèi)最重要的誘導(dǎo)細胞凋亡的分子之一,在多種肝炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。死亡受體5(Death receptor 5,DR5)是親和力最高的TRAIL受體,天然狀態(tài)下可以可溶性DR5(Soluble DR5,即sDR5)存在。sDR5能結(jié)合TRAIL,但不能傳導(dǎo)信號,從而阻斷TRAIL介導(dǎo)的細胞凋亡。本研究通過制備重組人sDR5和免疫球蛋白Fc片段(sDR5-Fc)融合蛋白,并對其在小鼠、大鼠和食蟹猴體內(nèi)的藥理、安全性、藥代動力學(xué)、療效和機制進行了研究。主要研究內(nèi)容包括以下4個方面:(1)sDR5-Fc蛋白的制備和特性研究。通過基因工程技術(shù),融合DR5細胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1 Fc片段基因,轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞,篩選獲得穩(wěn)定高表達sDR5-Fc的細胞株。通過大規(guī)模細胞培養(yǎng)和蛋白純化,獲得藥用級的sDR5-Fc蛋白,純度超過99%,親和力達E-10 M,能特異性結(jié)合TRAIL,有效阻斷TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡。(2)sDR5-Fc在刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)誘導(dǎo)肝炎模型中的藥效學(xué)研究。sDR5-Fc能有效治療Con A誘導(dǎo)的小鼠肝炎/肝衰竭。在機制上,sDR5-Fc在體內(nèi)可以抑制肝細胞死亡,減輕炎癥反應(yīng)。在體外,sDR5-Fc可以抑制Con A或抗CD3抗體激活的脾細胞產(chǎn)生炎性細胞因子,通過下調(diào)NF-κB的活化。與這些結(jié)果一致的是,TRAIL~( / )小鼠注射Con A后,或其脾細胞在Con A或抗CD3抗體激活后,產(chǎn)生的炎性細胞因子水平均比TRAIL~(+/+)小鼠顯著性低。(3)sDR5-Fc在APAP誘導(dǎo)肝炎模型中的藥效學(xué)研究。sDR5-Fc能有效治療APAP誘導(dǎo)的小鼠肝炎/肝衰竭。機制上,APAP誘導(dǎo)小鼠的肝損傷嚴(yán)重程度和死亡率與血清sTRAIL水平相關(guān)。APAP誘導(dǎo)大量CD11b~+Gr1~+中性粒細胞浸潤肝臟,這些細胞的膜表面表達TRAIL,可以分泌sTRAIL,殺傷表達DR5的肝細胞。另外,這些細胞表達CD80、CD86和MHCⅡ分子,可以促進T細胞增殖。APAP通過上調(diào)DR5的表達,使肝細胞對TRAIL誘導(dǎo)的細胞死亡更敏感。因此,TRAIL-DR5信號通路在APAP誘導(dǎo)的肝炎/肝衰竭中起關(guān)鍵的作用。sDR5-Fc能減少肝臟細胞的凋亡,減輕肝臟炎癥,恢復(fù)肝臟功能。sDR5-Fc能與N乙酰半胱氨酸協(xié)同治療APAP誘導(dǎo)的肝炎/肝衰竭。(4)sDR5-Fc的安全性研究。單次靜脈輸注sDR5-Fc的最大耐受劑量在小鼠、大鼠和食蟹猴中分別超過2198、1500和1200 mg/kg。重復(fù)靜脈輸注13周sDR5-Fc的未觀察到不良反應(yīng)劑量在大鼠和食蟹猴中分別為200和100 mg/kg。sDR5-Fc藥物呈線性動力學(xué)特征,在食蟹猴中平均半衰期1.9天。sDR5-Fc重復(fù)靜脈輸注給予食蟹猴12周后,sDR5-Fc暴露量以近似劑量比例增加,平均蓄積因子為1.82~2.11倍。sDR5-Fc靜脈注射給予大鼠后,主要分布在血漿,通過尿液排出。綜上所述,sDR5-Fc,作為第一個藥用TRAIL阻斷劑,在治療TRAIL驅(qū)動的肝炎、肝衰竭疾病中安全有效,有望發(fā)展成為新的肝炎、肝衰竭治療藥物。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R96
【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞說明
第1章 引言
    1.1 TRAIL分子及其受體簡介
    1.2 TRAIL信號通路
        1.2.1 TRAIL促凋亡信號通路
        1.2.2 TRAIL促壞死性凋亡信號通路
        1.2.3 TRAIL誘導(dǎo)的非細胞死亡信號通路
    1.3 肝炎/肝衰竭簡介
    1.4 TRAIL在肝炎/肝衰竭中的作用
    1.5 肝炎/肝衰竭的治療現(xiàn)狀
    1.6 sDR5阻斷TRAIL治療細胞死亡
第2章 sDR5-Fc新藥的制備和特性研究
    2.1 研究背景
        2.1.1 Fc融合蛋白研究現(xiàn)狀
        2.1.2 sDR5-Fc蛋白研究現(xiàn)狀
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗試劑
        2.2.2 實驗儀器
        2.2.3 實驗耗材
        2.2.4 建立穩(wěn)定表達sDR5-Fc蛋白的細胞庫
        2.2.5 sDR5-Fc蛋白的生產(chǎn)
        2.2.6 TRAIL殺傷活性檢測
        2.2.7 sDR5-Fc生物活性檢測
        2.2.8 sDR5-Fc與配體結(jié)合特異性檢測
        2.2.9 sDR5-Fc親和力檢測
        2.2.10 sDR5-Fc與Fc受體結(jié)合能力檢測
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 sDR5-Fc蛋白分子量與純度
        2.3.2 sDR5-Fc與不同物種來源TRAIL結(jié)合親和力
        2.3.3 sDR5-Fc體外生物活性
        2.3.4 sDR5-Fc結(jié)合配體特異性
        2.3.5 sDR5-Fc與多種Fc受體的結(jié)合活性
        2.3.6 sDR5-Fc與細胞膜表面DR5的結(jié)合活性
    2.4 討論
第3章 sDR5-Fc新藥的藥效學(xué)研究
    3.1 研究背景
        3.1.1 Con A誘導(dǎo)的肝炎
        3.1.2 APAP誘導(dǎo)的肝炎
    3.2 材料與方法
        3.2.1 建立Con A誘導(dǎo)的肝炎或肝衰竭模型
        3.2.2 建立APAP誘導(dǎo)的肝炎或肝衰竭模型
        3.2.3 小鼠外周血單個核細胞的分離
        3.2.4 小鼠脾臟細胞的分離
        3.2.5 小鼠肝臟免疫細胞的分離
        3.2.6 小鼠血清檢測
        3.2.7 吲哚菁綠清除法測肝臟功能
        3.2.8 流式細胞分析
        3.2.9 小鼠肝臟mRNA水平檢測
        3.2.10 組織病理檢測
        3.2.11 石蠟切片免疫組織化學(xué)染色
        3.2.12 冰凍切片免疫熒光染色
        3.2.13 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測
        3.2.14 脾細胞體外刺激培養(yǎng)
        3.2.15 肝細胞DR5 敲低
        3.2.16 CD11b~+Gr1~+細胞功能實驗
        3.2.17 細胞涂片免疫熒光染色和Giemsa染色
        3.2.18 統(tǒng)計分析方法
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 sDR5-Fc治療Con A誘導(dǎo)的急性肝炎/肝衰竭的藥效研究
        3.3.2 sDR5-Fc治療APAP誘導(dǎo)的急性肝炎/肝衰竭的藥效研究
    3.4 討論
        3.4.1 Con A與APAP誘導(dǎo)肝炎/肝衰竭模型的比較
        3.4.2 sDR5-Fc在Con A模型中的藥效討論
        3.4.3 sDR5-Fc在APAP模型中的藥效討論
第4章 sDR5-Fc新藥非臨床安全性研究
    4.1 研究背景
        4.1.1 免疫原性評價
        4.1.2 非臨床安全性評價
    4.2 材料與方法
        4.2.1 檢測血清中抗sDR5-Fc抗體含量的ELISA方法
        4.2.2 檢測血清中抗sDR5或抗Fc抗體含量的ELISA方法
        4.2.3 檢測猴血清中sDR5-Fc濃度的ELISA方法
        4.2.4 生產(chǎn)人Fc和sDR5蛋白
        4.2.5 安全性評價動物實驗
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 sDR5和Fc蛋白生產(chǎn)
        4.3.2 檢測血清中抗sDR5或抗Fc抗體含量
        4.3.3 檢測血清中抗sDR5-Fc抗體含量
        4.3.4 檢測猴血清中sDR5-Fc濃度
        4.3.5 sDR5-Fc單次靜脈輸注毒性研究
        4.3.6 sDR5-Fc重復(fù)靜脈輸注毒性研究
        4.3.7 sDR5-Fc的藥代動力學(xué)研究
        4.3.8 sDR5-Fc的分布及排泄研究
    4.4 討論
第5章 結(jié)論與展望
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷
博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
博士期間發(fā)表的專利
博士期間參加的主要研究項目
博士期間所獲得的獎勵

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

本文編號：2829365