納米技術(shù)可廣泛用于癌癥治療。然而,傳統(tǒng)納米藥物以載體為主要構(gòu)建基礎(chǔ),載體多樣且復(fù)雜,導(dǎo)致納米藥物的載藥量低,制備復(fù)雜,缺乏重復(fù)性和可控性,難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和臨床轉(zhuǎn)化。自組裝納米藥物以藥物為構(gòu)建單元,利用藥物自身的組裝特性,可極大地降低載體的使用量,提高藥物的包封率和載藥量,避免載體所帶來的免疫原性和毒性等安全隱憂,制備簡單,可控性高、穩(wěn)定性好,有望推進納米藥物的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床轉(zhuǎn)化。據(jù)此,我們以阿霉素(doxorubicin,DOX)和順鉑(cisplatin,Pt)為模型藥物,構(gòu)建了兩種自組裝納米藥物遞送系統(tǒng),以提高治療效果并降低毒副作用,同時避免傳統(tǒng)納米藥物遞送系統(tǒng)的不足之處。針對DOX的副作用,我們利用小分子藥物二氯乙酸(dichloroacetic acid,DCA)合成DOX-DCA偶聯(lián)體,促進DOX自組裝性能;針對Pt的耐藥現(xiàn)象和不良反應(yīng),我們聯(lián)合化療增強劑和耐藥抑制劑阿杜丁(adjudin,ADD),合成一系列兩親性的藥物-藥物偶聯(lián)體,包括ADD單取代的、具有不同碳鏈長度的Pt(IV)前藥:C_2-Pt-ADD、C_4-Pt-ADD、C_6-Pt-ADD、C_8-Pt-ADD、C_(12)-Pt-ADD和ADD雙取代的Pt(IV)前藥Pt-2ADD,探索ADD取代度和碳鏈長度這兩種因素對藥物自組裝性能和腫瘤殺傷能力的影響。通過~1H NMR、~(13)C NMR、MS或HPLC等多種手段驗證所合成各化合物的結(jié)構(gòu)和純度;評價兩類藥物-藥物偶聯(lián)體的自組裝性能,分析其自組裝能力的強弱;測定并觀察各自組裝納米粒的粒徑、電位、形貌、穩(wěn)定性以及藥物的包封率和載藥量等;對兩類自組裝納米粒進行體外細胞實驗評價,包括攝取情況、胞內(nèi)藥動學(xué)、體外殺傷或者凋亡情況等;探索兩類自組裝納米粒(nanoparticles,NPs)的體外抑瘤情況;同時針對DOX-DCA NPs還開展了藥物分布研究和體內(nèi)安全性評價。結(jié)果顯示,兩種藥物-藥物偶聯(lián)體:DOX-DCA和Pt(IV)-ADD(C_2-Pt-ADD、C_4-Pt-ADD、C_6-Pt-ADD、C_8-Pt-ADD、C_(12)-Pt-ADD和Pt-2ADD)均成功合成,藥物的純度均大于98%,并可自組裝形成納米結(jié)構(gòu)。DOX-DCA NPs的粒徑為55.8 nm,電位為-28.6±1.1 mV,電鏡下呈均一、分散的球形。制備簡單、方便,載藥量高達71.8±1.7%。經(jīng)B16F10小鼠黑色素瘤細胞攝取后,DOX-DCA NPs可慢慢聚集到細胞核,發(fā)揮抗腫瘤效果。同時在胞內(nèi)酸性或酯酶存在的條件下,部分DOX-DCA可慢慢裂解生成DOX。相比于游離DOX,DOX-DCA NPs的體外抗腫瘤效果略差,這可能與其攝取和降解較慢等相關(guān)。此外,染料DIR標記的DOX-DCA NPs的腫瘤靶向性好,其腫瘤局部的藥物分布是游離染料DIR的39.4~48.2倍。在肝癌H22動物模型中,DOX和DOX-DCA NPs的腫瘤治療效果相當;而在黑色素瘤B16F10動物模型中,DOX-DCA NPs的抗腫瘤效果比游離藥物DOX略差,但劑量提高至15 mg/kg后,其治療效果和安全性均好于DOX。最大耐受劑量實驗(maximum tolerated dosage,MTD)實驗進一步表明DOX-DCA NPs可顯著降低DOX所致的心臟和肝臟毒性,體內(nèi)安全性好。DOX-DCA NPs的MTD為75mg DOX equiv./kg,是游離藥物DOX(5 mg/kg)的15倍。同時游離藥物DOX 10mg/kg和DOX 15mg/kg給藥組均出現(xiàn)明顯的心臟損傷和肝臟損傷。且DOX 15mg/kg給藥組小鼠血漿中血生化參數(shù)LDH、ALT和AST水平發(fā)生顯著性變化,而DOX-DCA NPs給藥組均無明顯改變。一系列Pt(IV)-ADD藥物-藥物偶聯(lián)體均可在水中自組裝形成納米粒。引入磷脂DSPE-PEG后,形成Pt(IV)-ADD@DSPE-PEG NPs,其穩(wěn)定性大大提高。各納米粒的粒徑在60-140 nm之間,PDI值較小,電鏡下呈現(xiàn)均一、分散的球形。隨著碳鏈長度的增加,納米粒的粒徑逐漸增大。Pt(IV)-ADD前藥在上述納米粒中的包封率(78.8%-92.6%)和載藥量(84.0%-86.0%)均高于目前絕大多數(shù)納米藥物。六種納米粒的穩(wěn)定性有所差異,其中C_2-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs、C_8-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs、C_(12)-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和Pt-2ADD@DSPE-PEG NPs的穩(wěn)定性較好,在PBS中可穩(wěn)定存在270 d;而C_4-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和C_6-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs的穩(wěn)定性時長僅分別為48 h和24 h。自組裝納米系統(tǒng)是一個動態(tài)的過程,C_4-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和C_6-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs會發(fā)生結(jié)構(gòu)的二次自組裝,進而產(chǎn)生形態(tài)的改變,分別傾向形成纖維和層狀這兩種熱力學(xué)更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。為了驗證上述納米粒的抗腫瘤效果,在體外細胞殺傷實驗中,我們分別運用了以下三種細胞系:順鉑耐藥細胞(三陰性乳腺癌MDA-MB-231)和敏感細胞(肝癌HepG2、非小細胞肺癌A549)。各游離藥物或其自組裝納米粒的殺傷效果強弱大體如下:C_4-Pt-ADDC_6-Pt-ADDC_2-Pt-ADDC_8-Pt-ADDC_(12)-Pt-ADDPt-2ADD。C_4-Pt-ADD和C_6-Pt-ADD的殺傷能力較好,可能與其結(jié)構(gòu)可發(fā)生二次重排有關(guān)。在敏感和耐藥細胞中,自組裝藥物均展示出顯著增強的抗腫瘤效果,其中在耐藥細胞中,其殺傷指數(shù)最高可增強266.4倍,可以大幅減輕順鉑的耐藥問題。體內(nèi)耐藥腫瘤抑制實驗表明C_2-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs可幾乎完全抑制腫瘤的生長,并有效減輕順鉑引起的體重下降問題,具有很好的體內(nèi)安全性。綜上所述,本課題成功構(gòu)建了兩種基于藥物-藥物偶聯(lián)體的自組裝納米藥物遞送系統(tǒng),成功的克服了DOX的副作用和順鉑在治療過程中的耐藥問題和不良反應(yīng),兩種納米體系制備簡單、載藥量高,有效降低了載體的使用量,可克服傳統(tǒng)納米粒中載體的復(fù)雜性和多樣性所帶來的問題,為納米粒的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床轉(zhuǎn)化提供新思路。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文的納米藥物，自組裝納米藥物的組成明確，可以降低載體的使用量和多樣性，降低納米體系的復(fù)雜性，減少載體所帶來的一系列問題。⑤通常自組裝納米藥物的制備方法為納米沉降法，屬于自下而上的制備方式，操作簡單，為納米藥物的大規(guī)模生產(chǎn)提供了極大的可能性[11, 13-15]。綜上，利用上述自組裝納米藥物可大大降低載體的使用量和種類，提高藥物的包封率和載藥量，減少藥物浪費，避免制備中引入大量載體而引起的生產(chǎn)成本增加、代謝、排泄和免疫原性等安全隱憂，降低納米體系的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，推動納米藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

安全性研究Doxorubicin,DOX）是一種廣譜抗腫瘤藥物，臨床上常用于，卡波西肉瘤，淋巴瘤和急性淋巴細胞性白血病等多種疾方式主要為直接插入DNA雙鏈中或抑制DNA拓撲異構(gòu)酶錄和生物大分子的合成。此外，DOX還可以生成超氧自由和功能。然而，DOX的臨床應(yīng)用極大地受到了其急性和慢臟毒性、骨髓抑制、肝毒性、腦毒性、嘔吐、惡心和靜脈硬產(chǎn)生副作用的具體機制目前尚不清楚，但多數(shù)學(xué)者認ygen species, ROS）的生成和氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活在其毒用[1, 4]。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文1H), 2.14 (m, 2H), 2.93 (m, 2H), 3.4 (s, 1H), 3.97 (s, 3H), 4.2 (q, 1H), 4.58 (s, 2H),4.87 (s, 1H), 4.92 (m, 1H), 5.05 (d, 1H), 5.25 (d, 1H), 5.45 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 7.63(m, 1H), 7.88 (m, 2H), 8.34 (d, 1H), 13.25 (s, 1H), 14.02 (s, 1H). ESI-MS (negativemode) C29H29Cl2NO12: [M-H]-, cald, (m/z) 652.1; found, 652.3. Purity (HPLC): 98.5%.

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