納米技術(shù)可廣泛用于癌癥治療。然而,傳統(tǒng)納米藥物以載體為主要構(gòu)建基礎(chǔ),載體多樣且復(fù)雜,導(dǎo)致納米藥物的載藥量低,制備復(fù)雜,缺乏重復(fù)性和可控性,難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和臨床轉(zhuǎn)化。自組裝納米藥物以藥物為構(gòu)建單元,利用藥物自身的組裝特性,可極大地降低載體的使用量,提高藥物的包封率和載藥量,避免載體所帶來的免疫原性和毒性等安全隱憂,制備簡單,可控性高、穩(wěn)定性好,有望推進(jìn)納米藥物的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床轉(zhuǎn)化。據(jù)此,我們以阿霉素(doxorubicin,DOX)和順鉑(cisplatin,Pt)為模型藥物,構(gòu)建了兩種自組裝納米藥物遞送系統(tǒng),以提高治療效果并降低毒副作用,同時(shí)避免傳統(tǒng)納米藥物遞送系統(tǒng)的不足之處。針對(duì)DOX的副作用,我們利用小分子藥物二氯乙酸(dichloroacetic acid,DCA)合成DOX-DCA偶聯(lián)體,促進(jìn)DOX自組裝性能;針對(duì)Pt的耐藥現(xiàn)象和不良反應(yīng),我們聯(lián)合化療增強(qiáng)劑和耐藥抑制劑阿杜丁(adjudin,ADD),合成一系列兩親性的藥物-藥物偶聯(lián)體,包括ADD單取代的、具有不同碳鏈長度的Pt(IV)前藥:C_2-Pt-ADD、C_4-Pt-ADD、C_6-Pt-ADD、C_8-Pt-ADD、C_(12)-Pt-ADD和ADD雙取代的Pt(IV)前藥Pt-2ADD,探索ADD取代度和碳鏈長度這兩種因素對(duì)藥物自組裝性能和腫瘤殺傷能力的影響。通過~1H NMR、~(13)C NMR、MS或HPLC等多種手段驗(yàn)證所合成各化合物的結(jié)構(gòu)和純度;評(píng)價(jià)兩類藥物-藥物偶聯(lián)體的自組裝性能,分析其自組裝能力的強(qiáng)弱;測定并觀察各自組裝納米粒的粒徑、電位、形貌、穩(wěn)定性以及藥物的包封率和載藥量等;對(duì)兩類自組裝納米粒進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià),包括攝取情況、胞內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、體外殺傷或者凋亡情況等;探索兩類自組裝納米粒(nanoparticles,NPs)的體外抑瘤情況;同時(shí)針對(duì)DOX-DCA NPs還開展了藥物分布研究和體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,兩種藥物-藥物偶聯(lián)體:DOX-DCA和Pt(IV)-ADD(C_2-Pt-ADD、C_4-Pt-ADD、C_6-Pt-ADD、C_8-Pt-ADD、C_(12)-Pt-ADD和Pt-2ADD)均成功合成,藥物的純度均大于98%,并可自組裝形成納米結(jié)構(gòu)。DOX-DCA NPs的粒徑為55.8 nm,電位為-28.6±1.1 mV,電鏡下呈均一、分散的球形。制備簡單、方便,載藥量高達(dá)71.8±1.7%。經(jīng)B16F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞攝取后,DOX-DCA NPs可慢慢聚集到細(xì)胞核,發(fā)揮抗腫瘤效果。同時(shí)在胞內(nèi)酸性或酯酶存在的條件下,部分DOX-DCA可慢慢裂解生成DOX。相比于游離DOX,DOX-DCA NPs的體外抗腫瘤效果略差,這可能與其攝取和降解較慢等相關(guān)。此外,染料DIR標(biāo)記的DOX-DCA NPs的腫瘤靶向性好,其腫瘤局部的藥物分布是游離染料DIR的39.4~48.2倍。在肝癌H22動(dòng)物模型中,DOX和DOX-DCA NPs的腫瘤治療效果相當(dāng);而在黑色素瘤B16F10動(dòng)物模型中,DOX-DCA NPs的抗腫瘤效果比游離藥物DOX略差,但劑量提高至15 mg/kg后,其治療效果和安全性均好于DOX。最大耐受劑量實(shí)驗(yàn)(maximum tolerated dosage,MTD)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明DOX-DCA NPs可顯著降低DOX所致的心臟和肝臟毒性,體內(nèi)安全性好。DOX-DCA NPs的MTD為75mg DOX equiv./kg,是游離藥物DOX(5 mg/kg)的15倍。同時(shí)游離藥物DOX 10mg/kg和DOX 15mg/kg給藥組均出現(xiàn)明顯的心臟損傷和肝臟損傷。且DOX 15mg/kg給藥組小鼠血漿中血生化參數(shù)LDH、ALT和AST水平發(fā)生顯著性變化,而DOX-DCA NPs給藥組均無明顯改變。一系列Pt(IV)-ADD藥物-藥物偶聯(lián)體均可在水中自組裝形成納米粒。引入磷脂DSPE-PEG后,形成Pt(IV)-ADD@DSPE-PEG NPs,其穩(wěn)定性大大提高。各納米粒的粒徑在60-140 nm之間,PDI值較小,電鏡下呈現(xiàn)均一、分散的球形。隨著碳鏈長度的增加,納米粒的粒徑逐漸增大。Pt(IV)-ADD前藥在上述納米粒中的包封率(78.8%-92.6%)和載藥量(84.0%-86.0%)均高于目前絕大多數(shù)納米藥物。六種納米粒的穩(wěn)定性有所差異,其中C_2-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs、C_8-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs、C_(12)-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和Pt-2ADD@DSPE-PEG NPs的穩(wěn)定性較好,在PBS中可穩(wěn)定存在270 d;而C_4-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和C_6-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs的穩(wěn)定性時(shí)長僅分別為48 h和24 h。自組裝納米系統(tǒng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,C_4-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和C_6-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)的二次自組裝,進(jìn)而產(chǎn)生形態(tài)的改變,分別傾向形成纖維和層狀這兩種熱力學(xué)更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。為了驗(yàn)證上述納米粒的抗腫瘤效果,在體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中,我們分別運(yùn)用了以下三種細(xì)胞系:順鉑耐藥細(xì)胞(三陰性乳腺癌MDA-MB-231)和敏感細(xì)胞(肝癌HepG2、非小細(xì)胞肺癌A549)。各游離藥物或其自組裝納米粒的殺傷效果強(qiáng)弱大體如下:C_4-Pt-ADDC_6-Pt-ADDC_2-Pt-ADDC_8-Pt-ADDC_(12)-Pt-ADDPt-2ADD。C_4-Pt-ADD和C_6-Pt-ADD的殺傷能力較好,可能與其結(jié)構(gòu)可發(fā)生二次重排有關(guān)。在敏感和耐藥細(xì)胞中,自組裝藥物均展示出顯著增強(qiáng)的抗腫瘤效果,其中在耐藥細(xì)胞中,其殺傷指數(shù)最高可增強(qiáng)266.4倍,可以大幅減輕順鉑的耐藥問題。體內(nèi)耐藥腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)表明C_2-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs可幾乎完全抑制腫瘤的生長,并有效減輕順鉑引起的體重下降問題,具有很好的體內(nèi)安全性。綜上所述,本課題成功構(gòu)建了兩種基于藥物-藥物偶聯(lián)體的自組裝納米藥物遞送系統(tǒng),成功的克服了DOX的副作用和順鉑在治療過程中的耐藥問題和不良反應(yīng),兩種納米體系制備簡單、載藥量高,有效降低了載體的使用量,可克服傳統(tǒng)納米粒中載體的復(fù)雜性和多樣性所帶來的問題,為納米粒的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床轉(zhuǎn)化提供新思路。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文的納米藥物，自組裝納米藥物的組成明確，可以降低載體的使用量和多樣性，降低納米體系的復(fù)雜性，減少載體所帶來的一系列問題。⑤通常自組裝納米藥物的制備方法為納米沉降法，屬于自下而上的制備方式，操作簡單，為納米藥物的大規(guī)模生產(chǎn)提供了極大的可能性[11, 13-15]。綜上，利用上述自組裝納米藥物可大大降低載體的使用量和種類，提高藥物的包封率和載藥量，減少藥物浪費(fèi)，避免制備中引入大量載體而引起的生產(chǎn)成本增加、代謝、排泄和免疫原性等安全隱憂，降低納米體系的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，推動(dòng)納米藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。

安全性研究Doxorubicin,DOX）是一種廣譜抗腫瘤藥物，臨床上常用于，卡波西肉瘤，淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞性白血病等多種疾方式主要為直接插入DNA雙鏈中或抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶錄和生物大分子的合成。此外，DOX還可以生成超氧自由和功能。然而，DOX的臨床應(yīng)用極大地受到了其急性和慢臟毒性、骨髓抑制、肝毒性、腦毒性、嘔吐、惡心和靜脈硬產(chǎn)生副作用的具體機(jī)制目前尚不清楚，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)ygen species, ROS）的生成和氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活在其毒用[1, 4]。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文1H), 2.14 (m, 2H), 2.93 (m, 2H), 3.4 (s, 1H), 3.97 (s, 3H), 4.2 (q, 1H), 4.58 (s, 2H),4.87 (s, 1H), 4.92 (m, 1H), 5.05 (d, 1H), 5.25 (d, 1H), 5.45 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 7.63(m, 1H), 7.88 (m, 2H), 8.34 (d, 1H), 13.25 (s, 1H), 14.02 (s, 1H). ESI-MS (negativemode) C29H29Cl2NO12: [M-H]-, cald, (m/z) 652.1; found, 652.3. Purity (HPLC): 98.5%.

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