脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細胞壁外膜上的主要成分,不但能夠阻礙抗菌藥物進入細菌內(nèi)部發(fā)揮抗菌作用,而且還是引發(fā)炎癥反應的主要誘因。失控的局部炎癥反應會導致全身性炎癥或膿毒癥等疾病,對組織和器官引起不同程度的損傷,嚴重的甚至會導致生物體死亡。目前還沒有開發(fā)出能夠有效中和LPS的成熟藥物�？咕膩碓磸V泛,作為生物體先天免疫系統(tǒng)的重要成員,具有廣譜抗菌活性且不易產(chǎn)生耐藥性等特點,某些抗菌肽還具有中和LPS及調(diào)節(jié)免疫功能,是研發(fā)拮抗LPS抗炎藥物的理想候選。Chensinin-1是本實驗室從中國林蛙(Ranachensinensis)皮膚分泌物中分離純化得到的一種含有18個氨基酸的短肽,該抗菌肽具有分子量小,陽離子性強等特征,對革蘭氏陽性菌有較好的抗菌活性。前期研究中對chensinin-1進行改造,以疏水性較強的色氨酸替換了疏水性較弱的甘氨酸,并調(diào)整氨基酸序列增強了其兩親性得到了它的改造肽chensinin-1b,其抗菌活性尤其是對革蘭氏陰性菌的抗菌能力與模板肽相比有顯著的提高。本文首先研究了 chensinin-1b對革蘭氏陰性菌選擇性殺菌活性的分子機制。NPN檢測chensinin-1b對細菌細胞壁外膜的滲透性,結(jié)果表明chensinin-1b對大腸桿菌外膜有較強的滲透能力,chensinin-1相對較弱。制備去除細胞壁外膜的大腸桿菌原生質(zhì)體,兩種抗菌肽對原生質(zhì)體的去極化作用和抗菌活性與大腸桿菌相比均有不同程度提高,而對LPS環(huán)境中的原生質(zhì)體的去極化及抗菌能力又有所下降,其中chensinin-1下降的程度較chensinin-1b 更大,說明 chensinin-1 無法像 chensinin-1b 一樣作用于 LPS,提示chensinin-1和chensinin-1b對革蘭氏陰性細菌抗菌活性的不同,是由于二者對革蘭氏陰性菌細胞壁外膜中LPS作用程度不同引起的。等溫滴定量熱(isothermaltitrationcalorimetry,ITC)實驗和Zeta電勢實驗測定chensinin-lb與LPS之間的相互作用。ITC顯示,chensinin-1b與LPS的結(jié)合是一個先放熱后吸熱的過程,先后由焓和熵驅(qū)動。表明chensinin-1b先以靜電作用和LPS吸附結(jié)合,再以疏水作用插入到LPS中。通過分析熱力學參數(shù),得出結(jié)論chensinin-1b的結(jié)合系數(shù)較大,說明與LPS有較強的結(jié)合能力,而chensinin-1較弱。Zeta電勢實驗從電荷補償?shù)姆矫嬉灿∽C了同樣的結(jié)果。動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)和FITC-LPS解聚實驗顯示chensinin-1b與LPS結(jié)合后,能不同程度解聚LPS聚集體,使聚合態(tài)的LPS分子粒徑由大變小,有利于chensinin-1b的插入。chensinin-1b對LPS的結(jié)合和解聚作用是chensinin-1b貫穿LPS的前提,熒光光譜顯示chensinin-1b的自發(fā)熒光吸收峰隨著LPS濃度的升高發(fā)生了藍移,并伴隨著熒光強度的升高。淬滅劑的加入并不能完全淬滅熒光,說明chensinin-1b插入到LPS疏水內(nèi)部使淬滅劑無法接觸進而產(chǎn)生淬滅作用。原位紅外光譜檢測LPS內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),隨著chensinin-1b作用時間的而增加,LPS內(nèi)部的磷酸基團結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,說明chensinin-1b能夠通過疏水作用貫穿LPS并導致LPS的解離。鱟試劑顯色實驗(Limulus amebocyte lysate test,LAL)顯示 chensinin-1b 可以很好的中和 LPS。LPS是炎癥反應信號通路的觸發(fā)劑,本文進一步研究了 chensinin-1b對LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7炎癥模型的影響。結(jié)果顯示chensinin-1b能夠抑制LPS誘導產(chǎn)生的炎癥因子和介質(zhì)如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)、一氧化氮(NO)的釋放。chensinin-1b對炎癥的抑制能力要強于chensinin-1。在對RAW264.7作用中,利用激光共聚焦顯微鏡觀察到抗菌肽chensinin-1b能夠在短時間內(nèi)就進入到RAW264.7細胞內(nèi)部,這意味著chensinin-1b可以在細胞內(nèi)部發(fā)揮抗炎作用。我們使用chensinin-1b預處理方法考察chensinin-1b在RAW264.7細胞內(nèi)部的抗炎作用,結(jié)果顯示chensinin-1b的預處理能夠降低炎癥因子TNF-α、IL-6的含量,對炎癥因子的抑制率約占正常處理組的80%以上,也就是說chensinin-1b在細胞外部中和LPS并非是它抑制炎癥的主要途徑,在細胞內(nèi)部的作用才是chensinin-1b的主要抗炎機制。Western Blot檢測了 chensinin-1b對胞漿蛋白NOD1和NOD2表達的影響,結(jié)果顯示chensinin-1b可以抑制LPS誘導的NOD1和NOD2的過表達。NOD1和NOD2可激活下游的核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路,使用RT-qPCR,檢測到抗菌肽chensinin-1b抑制了 NOD1/NOD2介導通路蛋白NF-κB的mRNA表達,Western Blot結(jié)果表明chensinin-1b對MAPK信號通路中的主要通路蛋白ERK/JNK/p38的磷酸化水平也有顯著的抑制作用。利用細胞膜去極化實驗研究了 chensinin-1b的內(nèi)化途徑,結(jié)果表明chensinin-1b并不能引起RAW264.7細胞膜電位的變化,說明chensinin-1b是以非破膜的方式進入到細胞內(nèi)部。通過研究低溫和多種內(nèi)吞抑制劑處理對chensinin-1b內(nèi)化的影響,發(fā)現(xiàn)chensinin-1b是以能量依賴的形式,并通過Na+/H+離子通道介導的內(nèi)吞途徑為主進入到細胞內(nèi)部,發(fā)揮抗炎作用。綜上所述,抗菌肽chensinin-1b有效抑制LPS誘導的炎癥因子和介質(zhì)的釋放,對LPS有較強的中和拮抗作用。但chensinin-1b中和LPS只在其抗炎活性中起一部分作用,更主要的抗炎機制是以能量依賴的Na+/H+離子通道介導的內(nèi)吞途徑為主進入到細胞內(nèi)部,通過在細胞內(nèi)部作用于胞漿蛋白NOD1/NOD2,并降低其介導的NF-κB和磷酸化的ERK/JNK/p38 的表達。
【學位單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R915
【部分圖文】：

介導ＮＦ－ｋＢ通路，控制炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄表達Ｐ７Ｉ。除了激活ＮＦ－ｋＢ途徑外，研究表逡逑明Ｎ０Ｄ１與Ｎ０Ｄ２受刺激后會招募下游的ＴＡＫ１，引起ＭＡＰＫ如ｐ３８、Ｅ民Ｋ和ＪＮＫ的逡逑活化產(chǎn)生炎癥反應。ＬＰＳ誘導的炎癥信號通路圖如圖１．２。逡逑Ｗ邐灥逡逑Ｖ邋ｙ邋Ｉ邋ｆ邐心？二邋７＼邋＼邐＼＼逡逑化公＼邐＼ｍＡＰＫ逡逑戶ＭＳＲ氣。Ｋ吟護ｍ柳逡逑Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ａｎｄ邋ｅｆｆｅｃｔｏｒ邋ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ逡逑圖１．２邋ＬＰＳ誘導的炎癥通路示惠圖巧Ｉ自Ｊ．邋Ｃｏｈｅｎ，機Ｎａｔｕｒｅ．邋２００２，４２０（６９１７）：郎５－９１）逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ａ邋ｃａｒｔｏｏｎ邋ｏｕｔｌｉｎｉｎｇ邋化ｅ邋ｐａ化ｗａｙｓ邋ｏｆ邋ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｍｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｉｎ邋化ｅ邋ｈｕｍａｎ邋ｂｏｄｙ（ｆｒｏｍ邋Ｊ．逡逑Ｃｏｈｅｎ．邋［Ｊ］．邋Ｎａｔｕｒｅ，邋２００２．４２０（６９１７）：８８５－９１），逡逑－７－逡逑

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本文編號：2828994