發(fā)布時(shí)間：2020-09-26 17:30

　　 本文以馬脾脫鐵蛋白(Horse spleen apoferritin,HSF)和海藻酸鈉(Sodium alginate,SA)作為納米包埋載體,利用鐵蛋白在極酸條件下可逆組裝特性和海藻酸鈉的控釋作用,包埋血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽丙氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸(Ala-His-Leu-Leu,AHLL),以期提高ACE抑制肽AHLL在消化系統(tǒng)中的吸收效果。以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。使用納米粒徑儀和透射電子顯微鏡觀察納米粒表征,運(yùn)用光譜掃描比較包埋處理后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,研究紫外輻射、溫度及pH值對(duì)納米粒穩(wěn)定性的影響。在模擬體外消化對(duì)AHLL納米粒吸收效果后,建立并驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞單層模型,運(yùn)用該模型進(jìn)行HSF-AHLL腸吸收機(jī)制研究。本文得出的主要結(jié)論如下:(1)制備納米粒的最優(yōu)條件是:載體鐵蛋白濃度在1~2μM之間,多糖濃度10mg/L,AHLL的終濃度在100~200μg/mL范圍內(nèi),可制備出包封率較高的納米粒體系。通過(guò)粒徑和電位測(cè)定,AHLL極有可能被包埋進(jìn)HSF空腔中,且經(jīng)過(guò)透射掃描電鏡對(duì)其表征,表觀上說(shuō)明HSF-AHLL和HSF-SA-AHLL形成了穩(wěn)定的納米體系。(2)紫外光譜說(shuō)明AHLL納米粒具有與HSF類似的大分子共軛結(jié)構(gòu);熒光光譜說(shuō)明AHLL納米粒只是改變了鐵蛋白在四重軸通道上的色氨酸微環(huán)境;從圓二色譜中可知:經(jīng)過(guò)包埋處理后蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量顯著減少,而β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加,說(shuō)明包埋后的蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化,從而使蛋白質(zhì)更加展開(kāi)。紫外光照24 h后,HSF-AHLL和HSF-SA-AHLL的降解率比單獨(dú)的AHLL分別降低了35.83%和43.86%;不同溫度處理60 min,80℃處降解率分別降低了26.96%和38.51%,說(shuō)明HSF-AHLL和HSF-SA-AHLL較游離的AHLL光照和熱穩(wěn)定性顯著提高。pH值對(duì)納米粒穩(wěn)定性的影響說(shuō)明,中性環(huán)境下HSF-AHLL納米粒的穩(wěn)定性最好。DSC實(shí)驗(yàn)說(shuō)明:包埋處理后的鐵蛋白結(jié)構(gòu)更加展開(kāi),與AHLL氫鍵的相互作用加強(qiáng),納米粒的熱穩(wěn)定性更好。體外模擬胃腸道系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),由于在胃道的極酸性環(huán)境下HSF亞基會(huì)打開(kāi),HSF-AHLL相比AHLL單獨(dú)進(jìn)入消化系統(tǒng),整體上看并沒(méi)有提高ACE抑制活性;而HSF-SA-AHLL進(jìn)入胃道后,SA的緩釋保護(hù)作用使得AHLL不被胃蛋白酶酶解,同時(shí)HSF-AHLL順利進(jìn)入腸道,在腸道的中性條件下穩(wěn)定性較好,從而有效吸收,ACE抑制活性顯著提高。(3)本實(shí)驗(yàn)室建立的Caco-2細(xì)胞模型結(jié)果為:Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)周期約為7~9 d,生長(zhǎng)較為緩慢,傳代的時(shí)間控制在4~5 d之間,消化時(shí)間控制在3~5 min之間;培養(yǎng)4~5 d,通過(guò)倒置顯微鏡觀察Caco-2細(xì)胞形成致密的單層結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)16 d后Caco-2細(xì)胞會(huì)分化成形態(tài)上與小腸上皮細(xì)胞相似的單層模型,腸腔側(cè)分化形成微絨毛與細(xì)胞間形成了完整的致密結(jié)構(gòu)。其單層模型的跨膜電阻值基本保持在650?·cm~2左右,Caco-2細(xì)胞單層腸腔側(cè)的堿性磷酸酶活性是基底側(cè)的堿性磷酸酶活性的17.71倍,說(shuō)明出現(xiàn)了明顯的極化現(xiàn)象;熒光黃AP→BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),其滲透系數(shù)也低于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)規(guī)定的1.0×10~(-6)cm/s。(4)運(yùn)用驗(yàn)證過(guò)的Caco-2細(xì)胞模型研究HSF-AHLL納米粒的細(xì)胞腸吸收機(jī)制結(jié)果為:通過(guò)MTT試驗(yàn)選擇濃度為100~200μg/mL的HSF-AHLL進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。同一時(shí)間內(nèi),HSF-AHLL納米粒明顯比單獨(dú)的AHLL在Caco-2細(xì)胞單層模型上轉(zhuǎn)運(yùn)量大,且表觀滲透系數(shù)(第120 min)也明顯高于后者。HSF-AHLL的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)均對(duì)時(shí)間有明顯的依懶性,且主動(dòng)運(yùn)輸和被動(dòng)運(yùn)輸同時(shí)存在。HSF-AHLL在AP→BL方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)為26.97×10~(-6)cm/s,而B(niǎo)L→AP方向的為5.79×10~(-6)cm/s,AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率遠(yuǎn)大于反向轉(zhuǎn)運(yùn)速率,說(shuō)明HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞單層吸收過(guò)程中吸收作用大于外排作用且具有一定方向性。HSF-AHLL在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)與溫度和pH值都有關(guān),且對(duì)樣品濃度有依賴性。在HSF-AHLL納米粒中AHLL終濃度為100μg/mL,供液pH值為7.4,溫度為37℃條件下,其轉(zhuǎn)運(yùn)滲透系數(shù)最高。加入外排作用的蛋白抑制劑的結(jié)果表明,AHLL是P-糖蛋白的外排底物且其外排主要是由MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的。內(nèi)吞抑制劑和肽載體抑制劑對(duì)AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有顯著影響,而脫氧膽酸鈉能顯著促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn),證明AHLL主要是通過(guò)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)小腸上皮細(xì)胞的。而這兩種抑制劑和脫氧膽酸鈉對(duì)HSF-AHLL的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收沒(méi)有顯著促進(jìn)作用,可能其是通過(guò)其他載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的。
【學(xué)位單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

圖 1-2 鐵蛋白空間結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1.2 Schematic diagram of ferritin spatial structure1.2.3 鐵蛋白的功能鐵蛋白在生物體內(nèi)扮演著重要角色，其調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡是通過(guò)儲(chǔ)存和釋放鐵離子的方式。當(dāng)機(jī)體察覺(jué) Fe2+濃度過(guò)高時(shí)，F(xiàn)ention 反應(yīng)啟動(dòng)，產(chǎn)生自由基[47]。羥基自由基由于其超強(qiáng)的氧化能力劇烈反應(yīng)，使細(xì)胞成分改變，并損失細(xì)胞完整性而使心臟、肝臟、腎臟等機(jī)體組織受損，促使患癌的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。尤其是，腦部沉積了過(guò)量的鐵，會(huì)造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到傷害，易患上帕金森和阿爾茨海默癥等疾病。而鐵蛋白通過(guò)氧化、移動(dòng)、礦質(zhì)鐵心的形成和生長(zhǎng)（去毒反應(yīng)）[48]，而將體內(nèi)多余的Ｆe2+貯存在鐵蛋白內(nèi)部，來(lái)保護(hù)機(jī)體免受損傷[49]。因此，鐵蛋白的雙重功能維持著鐵元素在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡。研究得出，植物鐵蛋白中的 EP 肽段與鐵離子的氧化沉淀及釋放活性有關(guān)。豌豆鐵蛋白（PSF）在鐵濃度很高時(shí)，其中的 EP 會(huì)使 Fe2+氧化沉淀；同時(shí) EP 片段特有的酶活，使鐵蛋白發(fā)生自降解，這一過(guò)程中鐵離子會(huì)快速釋放出來(lái)，這樣種子生長(zhǎng)需求

第二章 ACE 抑制肽 AHLL 納米粒的制備果與分析HLL 含量分析方法的建立標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的色譜條件下，AHLL 的保留時(shí)間為 8.97 min（圖 2-2）。精E 活性肽 AHLL，用 HBSS 平衡鹽溶液配制濃度為 20 mg/mL 的一系列濃度標(biāo)樣（5、10、50、100、200μg/mL）。以峰面積對(duì)質(zhì)出在空白HBSS中AHLL的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5.14466x+2.2248（3R2μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4-1 不同時(shí)間段 Caco-2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖rowth curve of Caco-2 monolayers at differen層的形態(tài)學(xué)觀察養(yǎng)瓶中的 Caco-2 細(xì)胞，細(xì)胞在瓶中貼的融合，形成單層結(jié)構(gòu)，顯微鏡下可清胞間連接緊密，形態(tài)呈 鋪路石 狀3 6 9 12 15 18 21 時(shí)間/d

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