鏈霉菌是微生物藥物主要生產(chǎn)菌,富含各類藥物合成元件和合成前體,具備完整的抗性/耐藥機制,是藥物異源合成的優(yōu)良底盤;其富含次級代謝基因簇,是天然活性產(chǎn)物的寶庫�；诠I(yè)菌構(gòu)建鏈霉菌底盤細胞,創(chuàng)建人工合成體系,有望創(chuàng)新遺傳育種技術(shù),從“一菌一藥、產(chǎn)物多組分”變革為“一底盤多藥、單一組分”的新模式,服務(wù)于新穎天然產(chǎn)物挖掘和微生物藥物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn),是微生物制藥領(lǐng)域的重要創(chuàng)新。恰塔努加鏈霉菌L10(Streptomyce schattanoogensis L10)是生產(chǎn)納他霉素(natamycin,PKS)的工業(yè)菌(產(chǎn)量高達16g/L),基因組為9Mb,含32個次級代謝生物合成基因簇,大部分是聚酮類。恰塔努加鏈霉菌L10中�；w豐富,具有高效調(diào)控網(wǎng)絡(luò),遺傳穩(wěn)定性強、遺傳操作簡單,有望開發(fā)為高效的聚酮類底盤細胞。本課題基于比較基因組學(xué)、泛基因組學(xué)及功能基因組學(xué)技術(shù),建立了系統(tǒng)分析鏈霉菌基因組中必需基因和冗余基因的方法。通過antiSMASH、IslandViewer4、ISsaga2對L10的基因組進行分析,定位了冗余基因元件如次級代謝生物合成基因簇(BGCs)、基因組島(GIs)、可移動元件(MGEs)的分布,表明冗余基因元件主要分布在染色體末端(60%的次級代謝基因簇、73.5%的基因組島、74%的插入序列);通過全基因組比對和泛基因組分析,將L10基因組明確劃分為高度保守的核心基因區(qū)(6.0Mb)和兩個亞端粒區(qū)(左右分別為2.0Mb和1.0Mb)兩部分;通過全蛋白質(zhì)組多重比對分析(OrthoVenn)和KEGG代謝通路分析,表明L10基因組中約有2700個必需基因,絕大部分與細胞基本構(gòu)架、初級代謝(如糖代謝、TCA循環(huán)、氨基酸代謝)、DNA功能(復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯)、細胞分裂等基本生命活動相關(guān),其余的約5500個基因則主要是與次級代謝途徑相關(guān)基因、致病性相關(guān)基因、可移動元件及噬菌體相關(guān)基因;綜合必需基因、冗余基因的功能及分布,準確界定了兩個大片段的冗余基因區(qū)域(1.3Mb和0.7Mb),為理性設(shè)計工業(yè)鏈霉菌底盤細胞提供了依據(jù)。課題優(yōu)化了Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng),用于大規(guī)模刪減冗余基因區(qū),構(gòu)建了鏈霉菌簡約基因組�；阪溍咕ㄓ幂d體pSET152和pKC1139構(gòu)建了 一系列鏈霉菌中通用的loxP或loxP突變位點快速整合載體,可廣泛應(yīng)用到其它鏈霉菌中。鑒于硫鏈絲菌素誘導(dǎo)型啟動子tipAp的本底表達高、硫鏈絲菌素對大部分鏈霉菌的毒性,優(yōu)化了 Cre酶誘導(dǎo)表達質(zhì)粒pALCre,用己內(nèi)酰胺誘導(dǎo)型啟動子nitAp替換了tipAp構(gòu)建了 pNitCre,只需用0.1%的ε-己內(nèi)酰胺便可誘導(dǎo)Cre酶的高效嚴謹表達,且己內(nèi)酰胺對絕大部分鏈霉菌不具有毒性,因此,也可廣泛應(yīng)用到其它鏈霉菌中。利用上述技術(shù),我們實現(xiàn)了 L10中兩個大片段冗余基因區(qū)域的高效缺失,構(gòu)建了兩個基因組簡化的恰塔努加鏈霉菌底盤細胞(L320和L321)。同時,完善了基因簇捕獲技術(shù),實現(xiàn)了 3個基因簇的直接克隆或組裝,推動了鏈霉菌合成生物學(xué)使能技術(shù)的發(fā)展。同時,本課題對恰塔努加鏈霉菌底盤細胞L321進行了系統(tǒng)的評估。與L10相比,L321展現(xiàn)出遺傳穩(wěn)定性增強、轉(zhuǎn)化效率提高、次級代謝譜簡化、異源蛋白和次級代謝產(chǎn)物表達能力增強、胞內(nèi)能量(ATP)和還原力(NADPH/NADP+)水平提高等優(yōu)良性能,且底盤細胞L321菌絲比較分散,不會在發(fā)酵過程中形成沉淀,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。以L321為基礎(chǔ),通過進一步遺傳改造,阻斷了主要副產(chǎn)物-氧化偶氮霉素的生物合成途徑,獲得了次級代謝譜更加簡化的底盤L325,最終表明L321和L325適合于聚酮類次級代謝產(chǎn)物異源合成,具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R915
【部分圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐第一章緒論逡逑缺失的大腸桿菌突變株（ＣＤＡ３４５６），共計缺失了邋３１３ｋｂ邋（圖１－１），但該敲除系統(tǒng)逡逑有一個缺點：基因組片段缺失以后會殘留一段序列，這些殘留的選擇標記序列或逡逑者位點特異性重組酶識別位點（／ｏｘ尸或需要從缺失突變株基因組中刪除［６１］。逡逑Ｋｍ＂邋ｋ邐Ｃｍ邋＿邋＾逡逑ＶＥ邐°＼ｒ邐ＶＥ逡逑ＦＰ－ｌｆｌ邋ｐＴｎＫｌｏｘＰ邋ｐＲＰ－１邐ＦＰ－ＭＩ邋ｐＴｎＣｌｏｘＰ邋ＵＲＰ－１逡逑Ｌ邋（３．４邋ｋｂ）邋Ｊ邐Ｌ邋（３．５邋ｋｂ）邋Ｉ逡逑．ｍＸ＾＾邐ａｍ／Ｓ—逡逑１邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋｜逡逑

較小基因組為合成生物學(xué)提供了一個平臺基因組，在該平臺基因組中細胞代逡逑謝產(chǎn)物和能量被有效的利用，直接合成目標代謝產(chǎn)物，而且在底盤基因組中代謝逡逑副產(chǎn)物可以降到最低，目標產(chǎn)物的質(zhì)量和穩(wěn)定性達到最高（圖１－４）。較小基因組逡逑９逡逑

種：一種是交換后恢復(fù)到野生型，另一種是產(chǎn)生靶基因缺失的突變株。通過大量逡逑篩選，可以篩選到靶基因缺失的突變株，用于后續(xù)基因功能研究。利用同源重組逡逑技術(shù)進行鏈霉菌基因組編輯的策略（以質(zhì)粒ＰＫＣ１１３９為例）如圖１－５：逡逑邐ｒ邋＂＂—＂—ｍ邐逡逑＾邐邐逡逑１１邐ＰＫＣ１Ｉ３９逡逑Ｘ邐Ｊ逡逑Ｓｉｎｇｌｅ邋Ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ逡逑ａｏｃＯＨＶ邋／？ＳＣ５邋ｏｎ邋ｏｒｉＴ￣ｉｒａＪ逡逑￣頓，邐Ｉ．．．．．邐１，１邋邋逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ邐Ｄ逡逑Ｄｏｕｂｌｅ邋Ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ逡逑野生型逡逑ｊ邐＾邋■邋■邋＇邋＇邋？邋＾邋■邋■邐■邋？邋．．—－．逡逑－ｆ－邋Ａ／Ｃ邋Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑邐邋二邐邐突變株逡逑Ｂ／Ｄ邋Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑圖１－５基于同源重組的基因敲除逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｇｅｎｅ邋ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑此外，ｐＫＣ１１３９質(zhì)粒中含有鏈霉菌溫敏型復(fù)制子／＾Ｇ５，在３４°Ｃ以上，該質(zhì)粒逡逑會丟失，可以在溫度及抗生素選擇壓力下促進質(zhì)粒與基因姐間的同源重組，提高逡逑篩選效率。而自殺質(zhì)粒則不含有鏈霉菌的復(fù)制子，因而不能在鏈霉菌體內(nèi)復(fù)制，逡逑質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移進入鏈霉菌體內(nèi)后

本文編號：2826901