發(fā)布時(shí)間：2020-09-25 17:13

　　 肝癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的兇手之一,其治愈率很難達(dá)到理想預(yù)期的主要原因在于:治療腫瘤的方法單一;長(zhǎng)期用藥后腫瘤產(chǎn)生明顯的耐藥性。本論文利用不同方法研究?jī)蓚�(gè)具有抗肝癌作用的小分子化合物:NT157和強(qiáng)心苷10-4-4的抗腫瘤機(jī)制,對(duì)發(fā)現(xiàn)新的高效抑癌藥物、研究藥物的抑瘤機(jī)制,乃至開發(fā)新藥以及治療癌癥意義重大。第一章研究NT157的抗肝癌分子機(jī)制。肝癌是一種在我國(guó)發(fā)生率較高的一種惡性腫瘤,多種生理或環(huán)境因素都可能誘發(fā)肝癌,因此明確治療肝癌藥物的作用靶點(diǎn)和機(jī)制就顯得尤為重要。NT157是小分子酪氨酸磷酸化抑制劑在細(xì)胞水平對(duì)多種癌細(xì)胞(結(jié)腸癌、前列腺癌等)有較強(qiáng)的抑制效果。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NT157在肝癌細(xì)胞中也具有較強(qiáng)的促凋亡作用,但是NT157在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制還未被研究。我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在蛋白水平對(duì)NT157抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行探索。利用細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),研究NT157在肝癌細(xì)胞中引起的蛋白質(zhì)的變化。結(jié)果表明NT157在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡作用中有5273個(gè)蛋白質(zhì)的變化,我們通過對(duì)這些蛋白的分類,幫助我們發(fā)現(xiàn)了 NT157在肝癌細(xì)胞中的新機(jī)制,能為該類多靶點(diǎn)抗腫瘤藥的研發(fā)提供幫助。第二章研究強(qiáng)心苷類藥物10-4-4靶向核受體Nur77的抗肝癌作用。傳統(tǒng)的強(qiáng)心苷主要用于治療包括心律不齊、慢性心功能不全等在內(nèi)的各種心臟類疾病,近些年來(lái)強(qiáng)心苷的抑制腫瘤作用逐漸被發(fā)現(xiàn)并引起了藥物學(xué)家的重視,但是傳統(tǒng)強(qiáng)心苷毒性較大,不良反應(yīng)眾多,不適于臨床癌癥的治療。這些不良反應(yīng)出現(xiàn)的原因主要在于強(qiáng)心苷分子機(jī)制還未被完全了解。我們前期篩選了一系列強(qiáng)心苷衍生物,發(fā)現(xiàn)化合物10-4-4具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。對(duì)10-4-4的研究發(fā)現(xiàn),它能夠誘導(dǎo)核受體Nur77的蛋白表達(dá),依賴Nur77的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期。對(duì)強(qiáng)心苷類藥物分子機(jī)制的探究,能夠在以后的研發(fā)過程中指導(dǎo)這一系列藥物的研發(fā),提高療效的同時(shí),減輕副作用。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋３：邋Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ邋Ｍａｓｓ邋Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ邋（ＭＳ）－ｂａｓｅｄ邋ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑摘自：Ｒｕｅｄｉ邋Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｍａｔｔｈｉａｓ邋Ｍａｎｎ．Ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ邋ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００３，１邋（５）：２５２－２６２．逡逑３．２蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物研究中的應(yīng)用逡逑藥物發(fā)現(xiàn)是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，它使用來(lái)自不同領(lǐng)域的各種工具。為了加速這逡逑一進(jìn)程，已經(jīng)開發(fā)出許多生物技術(shù)，包括基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)和一些細(xì)胞和有逡逑機(jī)方法學(xué)［２９］。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展面臨跨學(xué)科的挑戰(zhàn)，包括傳統(tǒng)（生物和化學(xué)）和逡逑新興（高通量自動(dòng)化和生物信息學(xué)）。新興技術(shù)包括二維凝膠電泳，質(zhì)譜，蛋白逡逑質(zhì)陣列，同位素編碼，雙雜交系統(tǒng)，信息技術(shù)和基于活性的分析。作為蛋白質(zhì)組逡逑學(xué)技術(shù)的一部分，這些技術(shù)正在推進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的實(shí)用性？。逡逑藥物發(fā)現(xiàn)過程涉及許多階段，包括目標(biāo)識(shí)別，信號(hào)通路識(shí)別，小分子優(yōu)化以逡逑６逡逑

但其對(duì)肝癌的作用尚無(wú)報(bào)道，為明確ＮＴ１５７是否對(duì)肝癌細(xì)胞具有抑制作逡逑用，我們對(duì)ＳＫ－Ｈｅｐ－丨肝癌細(xì)胞進(jìn)行ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ＮＴ１５７對(duì)ＳＫ－Ｈｅｐ－１逡逑肝癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了明顯的抑制作用，其ＩＣ５０為６．７６＾Ｍ邋（圖４Ａ）。為了進(jìn)逡逑一步說明ＮＴ１５７對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用是否是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，我們逡逑在不同的藥物作用濃度和時(shí)間下觀察ＰＡＲＰ蛋白的切割情況。研究表明ＮＴ１５７逡逑處理ＳＫ－Ｈｅｐ－１肝癌細(xì)胞６小鼠就出現(xiàn)了明顯的ＰＡＲＰ切割，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)印Ｍ逡逑的藥物濃度處理也出現(xiàn)了邋ＰＡＲＰ切割，這一方面說明ＭＴＴ的結(jié)果可信，也說明逡逑ＮＴ丨５７對(duì)細(xì)胞的凋亡作用有時(shí)間濃度依賴性（圖４Ｂ）。為了進(jìn)一步說明ＮＴ１５７逡逑的誘導(dǎo)凋亡作用，我們采用了邋ＤＡＰＩ染色顯示處理ＳＫ－Ｈｅｐ－１細(xì)胞，６小時(shí)后約逡逑６０．０％的細(xì)胞顯示出核冷凝和碎裂（圖５Ａ）。此外，細(xì)胞用ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色逡逑后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析顯示，２ｐＭＮＴ１５７處理細(xì)胞６小時(shí)，ＳＫ－Ｈｅｐ－１細(xì)胞發(fā)生逡逑廣泛的中晚期凋亡

ＮＴ丨５７對(duì)細(xì)胞的凋亡作用有時(shí)間濃度依賴性（圖４Ｂ）。為了進(jìn)一步說明ＮＴ１５７逡逑的誘導(dǎo)凋亡作用，我們采用了邋ＤＡＰＩ染色顯示處理ＳＫ－Ｈｅｐ－１細(xì)胞，６小時(shí)后約逡逑６０．０％的細(xì)胞顯示出核冷凝和碎裂（圖５Ａ）。此外，細(xì)胞用ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色逡逑后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析顯示，２ｐＭＮＴ１５７處理細(xì)胞６小時(shí)，ＳＫ－Ｈｅｐ－１細(xì)胞發(fā)生逡逑廣泛的中晚期凋亡，從０．５９％增加到１３％（圖５Ｂ）。逡逑Ａ邋１０0Ｌ邐１０５０＝６．７６０＾１邐Ｂ逡逑＾８０－ＮＴ１５７（１０ｈ）邐ＮＴ１５７（６｜ｉＭ）逡逑０邋２邋４邋６邋８邋１０＿邐０邋２邋４邋６邋８邋（ｈ）逡逑ｍＭＭＭｍ逡逑＾邐＼邐ＰＡＲＰ邐ＰＡＲＰ逡逑ｆ＇邐＼邐…邐邐逡逑２邋２０＊邐ｆ－ａｃｔｉｎ邋？＾丯邋Ｐ－ａｃｔｉｎ邋■邋■邋？邋廣逡逑２．５邐３．０邐３．５邐４．０邐４５逡逑ＬＯＧＩＯＣ逡逑圖４：邋ＮＴ１５７誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞ＳＫ－ＨＥＰ－ｌ凋亡。Ａ：ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ＮＴ１５７對(duì)ＳＫ－ＨＥＰ－ｌ逡逑的抑制增殖作用，其對(duì)細(xì)胞的ＩＣ５０為６．７６ｎＭ。Ｂ：使用時(shí)間梯度２、４、６、８、１０ｈ，濃度梯逡逑度２、４、６、８、１０ｐＭ分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，蛋白免疫印跡法測(cè)定ＮＴ１５７處理后的細(xì)胞中逡逑ＰＡＲＰ剪切蛋閂的表達(dá)水平。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４：邋ＮＴ１５７邋ｉｎｄｕｃｅｓ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａｔｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ邋ＳＫ－ＨＥＰ－ｌ．邋Ａ：邋ＭＴＴ邋ａｓｓａｙ逡逑ｄｅｔｅｃｔｓ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＮＴ邋１５７邋ｏｎ邋ＳＫ－ＨＥＰ－ｌ

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本文編號(hào)：2826841