目的:OAT2(Organic anion transporter 2/有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2)是一種SLC家族攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體,在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)與處置中扮演重要角色。解析OAT2表達(dá)的調(diào)控因子對(duì)深入理解藥物的動(dòng)力學(xué)行為及其影響因素等具有重要意義。核受體LRH-1(Liver receptor homolog 1/肝受體同系物-1)是一重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,調(diào)控多種轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的表達(dá)。然而,LRH-1是否調(diào)控OAT2尚不明確。本課題旨在考察LRH-1對(duì)OAT2的調(diào)控效應(yīng),以及闡明調(diào)控作用機(jī)制。方法:1.分別采用基因高表達(dá)和siRNA沉默技術(shù),高表達(dá)或敲低Lrh-1。采用實(shí)時(shí)熒光定量法、蛋白免疫印跡法對(duì)Oat2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。采用底物孵育法對(duì)Oat2的活性進(jìn)行測(cè)定。2.采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),考察核受體Lrh-1對(duì)Oat2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)合截?cái)鄦?dòng)子報(bào)告基因分析方法,分析核受體Lrh-1與Oat2啟動(dòng)子的作用區(qū)域。采用凝膠遷移和染色質(zhì)免疫共沉淀等生物學(xué)技術(shù)解析作用位點(diǎn)。3.采用siRNA沉默技術(shù),敲低Lrh-1。采用UPLC-QTOF/MS法,測(cè)定不同濃度和不同時(shí)間孵育條件下細(xì)胞內(nèi)多西他賽濃度,評(píng)價(jià)Lrh-1對(duì)多西他賽攝取活性的影響。4.基于Lrh-1肝特異性敲除(Lrh-1~(hep-/-))和野生型(Lrh-1~(fl/fl))小鼠模型,采用實(shí)時(shí)熒光定量法和蛋白免疫印跡法,檢測(cè)Lrh-1~(hep-/-)和Lrh-1~(fl/fl)小鼠肝臟中基因和蛋白的表達(dá)。5.分別采用Lrh-1~(hep-/-)和Lrh-1~(fl/fl)小鼠進(jìn)行多西他賽藥代動(dòng)力學(xué)研究。腹腔注射給予多西他賽(10 mg/kg)。于不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣和肝臟,采用UPLC-QTOF/MS法測(cè)定血漿及肝臟藥物濃度�；诜欠渴夷Ｐ�,評(píng)價(jià)多西他賽在Lrh-1~(hep-/-)和Lrh-1~(fl/fl)小鼠中藥動(dòng)學(xué)及組織分布差異。結(jié)果:1.核受體LRH-1/Lrh-1調(diào)控肝癌細(xì)胞中OAT2/Oat2的表達(dá)在Hepa1-6細(xì)胞中,高表達(dá)Lrh-1后,Oat2 m RNA表達(dá)升高1.2倍,蛋白表達(dá)升高80%;敲低Lrh-1后,Oat2 mRNA表達(dá)降低62%,蛋白表達(dá)降低55%。此外,敲低Lrh-1后,Hepa1-6細(xì)胞對(duì)PGE2的攝取減少77%。同時(shí),在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)或敲低LRH-1后,OAT2 mRNA表達(dá)也相應(yīng)升高或降低。2.Lrh-1肝臟敲除下調(diào)小鼠Oat2的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,Lrh-1在Lrh-1~(hep-/-)小鼠肝臟中不表達(dá)。Lrh-1的肝臟缺失導(dǎo)致Oat2mRNA表達(dá)降低80%。同時(shí),Oat2蛋白在Lrh-1~(hep-/-)小鼠肝臟中表達(dá)降低78%。3.核受體Lrh-1為Oat2的轉(zhuǎn)錄激活劑雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,Lrh-1顯著增強(qiáng)Oat2啟動(dòng)子活性。Oat2啟動(dòng)子活性與Lrh-1表達(dá)量呈正相關(guān)。截?cái)鄦?dòng)子報(bào)告基因分析顯示,Lrh-1調(diào)節(jié)Oat2啟動(dòng)子活性的核心區(qū)域位于-1.1和-0.4 kb之間(即-716至-702 bp區(qū)域)。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Oat2特異性探針與Lrh-1蛋白形成明顯的DNA-蛋白復(fù)合物。體內(nèi)CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Lrh-1抗體募集Oat2-LrhRE序列顯著增加。數(shù)據(jù)表明,Lrh-1通過其特異性結(jié)合于Oat2啟動(dòng)子-716至-702bp區(qū)域而激活Oat2的轉(zhuǎn)錄。4.Lrh-1敲低降低多西他賽細(xì)胞攝取體外不同時(shí)間和不同濃度攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低Lrh-1后,Hepa1-6細(xì)胞對(duì)多西他賽的攝取顯著降低。數(shù)據(jù)表明,敲低Lrh-1后Oat2蛋白表達(dá)的降低將直接引起Oat2對(duì)其底物攝取的減少。5.Lrh-1肝特異性敲除改變多西他賽藥動(dòng)學(xué)體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,特異性敲除肝臟Lrh-1后,多西他賽的藥動(dòng)學(xué)發(fā)生明顯改變。與Lrh-1~(fl/fl)小鼠相比,Lrh-1~(hep-/-)小鼠血漿藥物暴露量明顯增加。相反,在2小時(shí)時(shí)間內(nèi),Lrh-1~(hep-/-)小鼠肝臟中多西他賽濃度相對(duì)較低。同時(shí),多西他賽其它肝攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在Lrh-1~(hep-/-)小鼠肝臟中未發(fā)生改變。數(shù)據(jù)表明,Lrh-1通過調(diào)控Oat2的表達(dá)來改變肝臟對(duì)多西他賽的攝取,從而調(diào)節(jié)多西他賽的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布。結(jié)論:本研究首次揭示核受體Lrh-1在轉(zhuǎn)運(yùn)體Oat2和多西他賽藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用。Lrh-1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Oat2的表達(dá),從而影響Oat2底物藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布。本研究將有助于理解Oat2底物藥物的體內(nèi)過程,為Oat2底物藥物的個(gè)體化劑量設(shè)置提供參考。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

核受體的典型結(jié)構(gòu)

LRH-1的生理功能

多西他賽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

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3 卜凡莉;黑線倉鼠LRH-1的SNP及表達(dá)差異與胎仔數(shù)的關(guān)聯(lián)性研究[D];曲阜師范大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2826367