Caspase11及TNFAIP3炎性通路在甲基苯丙胺誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用研究
發(fā)布時(shí)間:2020-09-19 13:23
研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是世界上濫用最廣泛的藥物之一,主要效應(yīng)器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。METH可導(dǎo)致大腦以多巴胺神經(jīng)元為主的腦區(qū)損傷,神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死。METH還可致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性損傷,產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞聚集、釋放炎癥因子、膠質(zhì)瘢痕增生等改變。在METH神經(jīng)毒性損傷的眾多機(jī)制中,神經(jīng)炎性損傷的作用尚不明確。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,具有多種功能,在保護(hù)神經(jīng)元等方面發(fā)揮重要作用,其被激活后能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分化,產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,并參與炎性反應(yīng)。因此我們推測(cè),星形膠質(zhì)細(xì)胞在METH神經(jīng)炎性損傷中同樣發(fā)揮著不容忽視的作用。研究表明,Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)、Caspase11 以及NLRP3炎性體組成的經(jīng)典與非經(jīng)典的炎性通路在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。而TLR4引起下游NF-κB通路的過度激活,也可能是一些自身免疫性疾病發(fā)病的原因,A20作為NF-κB的胞內(nèi)抑制因子,在炎性通路調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用,可能成為METH神經(jīng)毒性的治療靶點(diǎn)。綜上所述,我們開展了 METH與星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)研究。研究目的:本課題擬研究METH誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的機(jī)制,星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性通路變化及其在神經(jīng)元毒性損傷中的作用和調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:通過建立METH染毒原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞及U87MG細(xì)胞模型,METH染毒動(dòng)物亞急性中毒模型,通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、基因干擾與過表達(dá)等技術(shù),探討炎性通路TLR4—Caspase11—NLRP3炎性體和A20—NF-κB的表達(dá)水平。另外通過建立METH染毒星形膠質(zhì)細(xì)胞—神經(jīng)元共培養(yǎng)模型,探討METH作用下兩種細(xì)胞的相互作用關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.METH染毒星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子IL-1β和IL-18高表達(dá),Caspase11—NLRP3炎性體非經(jīng)典炎性通路激活;2.原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予METH處理后,TLR4可以通過Myd88依賴和非依賴的途徑,介導(dǎo)NF-κB表達(dá)上調(diào)及入核增加,從而介導(dǎo)Caspase11及NLRP3炎性體通路相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄增加;3.建立星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)聯(lián)合METH給藥模型,星形膠質(zhì)細(xì)胞可以顯著降低共培養(yǎng)模型中由METH誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡、自噬、氧化應(yīng)激及DNA損傷水平;4.METH染毒細(xì)胞模型中,通過建立A20過表達(dá)和干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)A20能夠抑制TRAF6,也可以抑制NF-κB通路下游因子表達(dá)。結(jié)論:1.Caspase1 1通過炎性小體途徑促進(jìn)METH誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá);2.METH通過TLR4-NF-κB-Caspase11通路誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活;3.METH染毒的星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)后,神經(jīng)元的凋亡、自噬及氧化應(yīng)激水平顯著下調(diào);4.星形膠質(zhì)細(xì)胞在METH染毒后炎性通路被激活,A20通路同樣被激活。且對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞A20進(jìn)行過表達(dá)后,對(duì)細(xì)胞炎性通路有顯著抑制作用。
【學(xué)位單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位年份】:2019
【中圖分類】:R99
【部分圖文】:
圖1-1邋METH亞急性中毒小鼠中腦和紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞變化逡逑BL邋/邋6小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(n邋=邋5)。給動(dòng)物腹腔注射生理/針,每隔12邋h注射一次,共8針)。注射完畢后24邋h之后脫頸行GFAP免疫組織化學(xué)染色。比例尺:50hm逡逑hanges邋of邋astrocytes邋in邋the邋midbrain邋and邋striatal邋of邋METH邋subacutmice逡逑邋/邋6邋mice邋were邋randomly邋divided邋into邋control邋group邋and邋experimental邋ge邋injected邋intraperitoneally邋with邋saline邋or邋METH邋(15邋mg/kg/injection,邋8s).邋The邋mice邋were邋sacrificed邋by邋cervical邋dislocation邋24邋h邋after邋the邋last邋i邋extracted邋for邋immunohistochemical邋staining邋of邋GFAP.邋Scale邋bar:邋50邋|i誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子IL-ip和IL-18的表達(dá)逡逑一步確定METH處理后體內(nèi)及體外炎性反應(yīng)程度,我們兩個(gè)白介素因子進(jìn)行檢測(cè)。IL-1(3和IL-18均是促炎細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。Western邋blot結(jié)果顯示,METH亞急性
protein,邋GFAP)免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的骨架蛋逡逑白,膠質(zhì)纖維酸性蛋白,結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度超過95%,可逡逑以用于后續(xù)試驗(yàn)(圖1-3)。逡逑31逡逑
逡逑圖1-3原代星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定逡逑Figure邋1-3邋Purification邋of邋primary邋astrocytes逡逑我們觀察到,METH暴露后原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著變化。光逡逑鏡下發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞體中出現(xiàn)液泡樣分泌囊泡。通過Western邋blot檢測(cè)逡逑星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-ip和IL-18蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與METH劑量依呈現(xiàn)高度逡逑賴性(圖1-4)。這些數(shù)據(jù)表明METH暴露在體內(nèi)體外均可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,逡逑并誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)。逡逑Ctrl邐METH邋(2mM.24h)逡逑?邋?1邋t=l邋L-ip邐?逡逑\邋I'邋?、邐/邐?'邐METH邋0邋0.5邐10邋1.5邋2.0邐2.5邋mM邋|邐?邋1邋18邐圈逡逑iiUoDoJi逡逑y/邐邐邐邋METH邋0邋0邋5邋1邋0.5邋2邋0.5邐0邋0.5邋1邋0.3邋2邋0.9邋mM逡逑圖1>4原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞METH給藥后的形態(tài)變化和IL-ip和IL-18蛋白表達(dá)水平逡逑將原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用不同濃度的METH處理24邋h(0
【學(xué)位單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位年份】:2019
【中圖分類】:R99
【部分圖文】:
圖1-1邋METH亞急性中毒小鼠中腦和紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞變化逡逑BL邋/邋6小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(n邋=邋5)。給動(dòng)物腹腔注射生理/針,每隔12邋h注射一次,共8針)。注射完畢后24邋h之后脫頸行GFAP免疫組織化學(xué)染色。比例尺:50hm逡逑hanges邋of邋astrocytes邋in邋the邋midbrain邋and邋striatal邋of邋METH邋subacutmice逡逑邋/邋6邋mice邋were邋randomly邋divided邋into邋control邋group邋and邋experimental邋ge邋injected邋intraperitoneally邋with邋saline邋or邋METH邋(15邋mg/kg/injection,邋8s).邋The邋mice邋were邋sacrificed邋by邋cervical邋dislocation邋24邋h邋after邋the邋last邋i邋extracted邋for邋immunohistochemical邋staining邋of邋GFAP.邋Scale邋bar:邋50邋|i誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子IL-ip和IL-18的表達(dá)逡逑一步確定METH處理后體內(nèi)及體外炎性反應(yīng)程度,我們兩個(gè)白介素因子進(jìn)行檢測(cè)。IL-1(3和IL-18均是促炎細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。Western邋blot結(jié)果顯示,METH亞急性
protein,邋GFAP)免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的骨架蛋逡逑白,膠質(zhì)纖維酸性蛋白,結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度超過95%,可逡逑以用于后續(xù)試驗(yàn)(圖1-3)。逡逑31逡逑
逡逑圖1-3原代星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定逡逑Figure邋1-3邋Purification邋of邋primary邋astrocytes逡逑我們觀察到,METH暴露后原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著變化。光逡逑鏡下發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞體中出現(xiàn)液泡樣分泌囊泡。通過Western邋blot檢測(cè)逡逑星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-ip和IL-18蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與METH劑量依呈現(xiàn)高度逡逑賴性(圖1-4)。這些數(shù)據(jù)表明METH暴露在體內(nèi)體外均可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,逡逑并誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)。逡逑Ctrl邐METH邋(2mM.24h)逡逑?邋?1邋t=l邋L-ip邐?逡逑\邋I'邋?、邐/邐?'邐METH邋0邋0.5邐10邋1.5邋2.0邐2.5邋mM邋|邐?邋1邋18邐圈逡逑iiUoDoJi逡逑y/邐邐邐邋METH邋0邋0邋5邋1邋0.5邋2邋0.5邐0邋0.5邋1邋0.3邋2邋0.9邋mM逡逑圖1>4原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞METH給藥后的形態(tài)變化和IL-ip和IL-18蛋白表達(dá)水平逡逑將原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用不同濃度的METH處理24邋h(0
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6 Fatih 噻elik;Fatih Ulas;Zeynep Günes 銉zünal;Tülin F|rat;Serdal 噻elebi;
本文編號(hào):2822556
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