研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是世界上濫用最廣泛的藥物之一,主要效應(yīng)器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。METH可導(dǎo)致大腦以多巴胺神經(jīng)元為主的腦區(qū)損傷,神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死。METH還可致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性損傷,產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞聚集、釋放炎癥因子、膠質(zhì)瘢痕增生等改變。在METH神經(jīng)毒性損傷的眾多機(jī)制中,神經(jīng)炎性損傷的作用尚不明確。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,具有多種功能,在保護(hù)神經(jīng)元等方面發(fā)揮重要作用,其被激活后能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分化,產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,并參與炎性反應(yīng)。因此我們推測(cè),星形膠質(zhì)細(xì)胞在METH神經(jīng)炎性損傷中同樣發(fā)揮著不容忽視的作用。研究表明,Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)、Caspase11 以及NLRP3炎性體組成的經(jīng)典與非經(jīng)典的炎性通路在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。而TLR4引起下游NF-κB通路的過度激活,也可能是一些自身免疫性疾病發(fā)病的原因,A20作為NF-κB的胞內(nèi)抑制因子,在炎性通路調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用,可能成為METH神經(jīng)毒性的治療靶點(diǎn)。綜上所述,我們開展了 METH與星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)研究。研究目的:本課題擬研究METH誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的機(jī)制,星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性通路變化及其在神經(jīng)元毒性損傷中的作用和調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:通過建立METH染毒原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞及U87MG細(xì)胞模型,METH染毒動(dòng)物亞急性中毒模型,通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、基因干擾與過表達(dá)等技術(shù),探討炎性通路TLR4—Caspase11—NLRP3炎性體和A20—NF-κB的表達(dá)水平。另外通過建立METH染毒星形膠質(zhì)細(xì)胞—神經(jīng)元共培養(yǎng)模型,探討METH作用下兩種細(xì)胞的相互作用關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.METH染毒星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子IL-1β和IL-18高表達(dá),Caspase11—NLRP3炎性體非經(jīng)典炎性通路激活;2.原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予METH處理后,TLR4可以通過Myd88依賴和非依賴的途徑,介導(dǎo)NF-κB表達(dá)上調(diào)及入核增加,從而介導(dǎo)Caspase11及NLRP3炎性體通路相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄增加;3.建立星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)聯(lián)合METH給藥模型,星形膠質(zhì)細(xì)胞可以顯著降低共培養(yǎng)模型中由METH誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡、自噬、氧化應(yīng)激及DNA損傷水平;4.METH染毒細(xì)胞模型中,通過建立A20過表達(dá)和干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)A20能夠抑制TRAF6,也可以抑制NF-κB通路下游因子表達(dá)。結(jié)論:1.Caspase1 1通過炎性小體途徑促進(jìn)METH誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá);2.METH通過TLR4-NF-κB-Caspase11通路誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活;3.METH染毒的星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)后,神經(jīng)元的凋亡、自噬及氧化應(yīng)激水平顯著下調(diào);4.星形膠質(zhì)細(xì)胞在METH染毒后炎性通路被激活,A20通路同樣被激活。且對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞A20進(jìn)行過表達(dá)后,對(duì)細(xì)胞炎性通路有顯著抑制作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R99
【部分圖文】：

圖１－１邋ＭＥＴＨ亞急性中毒小鼠中腦和紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞變化逡逑ＢＬ邋／邋６小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（ｎ邋＝邋５）。給動(dòng)物腹腔注射生理／針，每隔１２邋ｈ注射一次，共８針）。注射完畢后２４邋ｈ之后脫頸行ＧＦＡＰ免疫組織化學(xué)染色。比例尺：５0ｈｍ逡逑ｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｍｉｄｂｒａｉｎ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｉａｔａｌ邋ｏｆ邋ＭＥＴＨ邋ｓｕｂａｃｕｔｍｉｃｅ逡逑邋／邋６邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｒａｎｄｏｍｌｙ邋ｄｉｖｉｄｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｇｅ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ邋ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ邋ｗｉｔｈ邋ｓａｌｉｎｅ邋ｏｒ邋ＭＥＴＨ邋（１５邋ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，邋８ｓ）．邋Ｔｈｅ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ邋ｂｙ邋ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ邋２４邋ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｅ邋ｌａｓｔ邋ｉ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｏｒ邋ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＧＦＡＰ．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ：邋５０邋｜ｉ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８的表達(dá)逡逑一步確定ＭＥＴＨ處理后體內(nèi)及體外炎性反應(yīng)程度，我們兩個(gè)白介素因子進(jìn)行檢測(cè)。ＩＬ－１（３和ＩＬ－１８均是促炎細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結(jié)果顯示，ＭＥＴＨ亞急性

ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＧＦＡＰ）免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。ＧＦＡＰ是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的骨架蛋逡逑白，膠質(zhì)纖維酸性蛋白，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度超過９５％，可逡逑以用于后續(xù)試驗(yàn)（圖１－３）。逡逑３１逡逑

逡逑圖１－３原代星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ逡逑我們觀察到，ＭＥＴＨ暴露后原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著變化。光逡逑鏡下發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞體中出現(xiàn)液泡樣分泌囊泡。通過Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)逡逑星形膠質(zhì)細(xì)胞ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與ＭＥＴＨ劑量依呈現(xiàn)高度逡逑賴性（圖１－４）。這些數(shù)據(jù)表明ＭＥＴＨ暴露在體內(nèi)體外均可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，逡逑并誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)。逡逑Ｃｔｒｌ邐ＭＥＴＨ邋（２ｍＭ．２４ｈ）逡逑？邋？１邋ｔ＝ｌ邋Ｌ－ｉｐ邐？逡逑＼邋Ｉ＇邋？、邐／邐？＇邐ＭＥＴＨ邋０邋０．５邐１０邋１．５邋２．０邐２．５邋ｍＭ邋｜邐？邋１邋１８邐圈逡逑ｉｉＵｏＤｏＪｉ逡逑ｙ／邐邐邐邋ＭＥＴＨ邋０邋０邋５邋１邋０．５邋２邋０．５邐０邋０．５邋１邋０．３邋２邋０．９邋ｍＭ逡逑圖１＞４原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ＭＥＴＨ給藥后的形態(tài)變化和ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８蛋白表達(dá)水平逡逑將原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用不同濃度的ＭＥＴＨ處理２４邋ｈ（０

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