目的阿爾茨海默氏癥(Alzheimer disease,AD)是最常見的一種神經(jīng)退行性疾病,也是老年人最常見的腦疾病之一,其主要病因是β-淀粉樣肽(Aβ)的沉積異常,高度磷酸化tau蛋白集聚形成的神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)以及神經(jīng)元喪失與突觸改變。加蘭他敏,目前在治療AD中的一線藥物,已被證明能有效減少Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用,但具體機(jī)制尚不清楚。本研究將闡明加蘭他敏抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬的分子機(jī)制,為更深一層解析AD的病理進(jìn)程和臨床治療AD提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法(1)采用MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)方法,探究加蘭他敏對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性的影響。(2)通過免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn),探究加蘭他敏對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬的作用。(3)運(yùn)用TUNEL和Hoechst染色以及免疫印跡方法,分析檢測加蘭他敏對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用。(4)采用免疫印跡和二氯二氫熒光素探針(DCFH-DA)的方法,探究加蘭他敏如何影響NOX4的表達(dá)和ROS的產(chǎn)生進(jìn)而抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬。(5)采用免疫組織化學(xué)技術(shù),從動物水平分析加蘭他敏對Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)元毒性損傷的影響。結(jié)果(1)加蘭他敏有效逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Aβ處理PC12細(xì)胞24 h后抑制細(xì)胞活力,并與Aβ呈濃度劑量依賴性,其IC50值約2μmol/L。加蘭他敏處理24 h后有效減弱Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性作用,且40μmol/L加蘭他敏效果最為明顯。此外,克隆形成實(shí)驗(yàn)也表明加蘭他敏能有效逆轉(zhuǎn)Aβ導(dǎo)致的PC12細(xì)胞增殖抑制。(2)加蘭他敏抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬。免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Aβ處理PC12細(xì)胞24 h后導(dǎo)致細(xì)胞自噬流和自噬體的形成,且加蘭他敏有效抑制這種Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬。(3)加蘭他敏抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。通過TUNEL檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn),Aβ顯著誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡,加蘭他敏在一定程度上能其誘導(dǎo)的凋亡。采用Hoechst 33342染細(xì)胞核評估細(xì)胞凋亡的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核顯示出高度濃縮和呈碎片樣形態(tài),經(jīng)過40μmol/L加蘭他敏共處理后,細(xì)胞和濃縮和凋亡的數(shù)量有所減少。此外,通過免疫印跡檢測caspase-3的活化情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TUNEL檢測和Hoechst染色結(jié)果一致。證明加蘭他敏能有效抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷性自噬。(4)加蘭他敏通過抑制NOX4的表達(dá)和ROS的產(chǎn)生進(jìn)而抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬。通過DCFH-DA熒光探針和免疫印跡檢測胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和NOX4的表達(dá),結(jié)果數(shù)據(jù)顯示Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加和NOX4的表達(dá)上調(diào),而加蘭他敏顯著抑制Aβ介導(dǎo)的ROS增加和NOX4表達(dá)上調(diào)。當(dāng)另外加入LPS共孵育細(xì)胞后,LPS能在一定程度上解除加蘭他敏對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬抑制作用。ROS清除劑NAC作為陽性對照,和加蘭他敏的作用效果一致。結(jié)果表明加蘭他敏通過抑制NOX4的表達(dá)和ROS的產(chǎn)生進(jìn)而抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬。(5)動物實(shí)驗(yàn)評價加蘭他敏通過抑制Aβ介導(dǎo)的自噬起到的神經(jīng)元保護(hù)作用。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測大鼠動物模型大腦皮層海馬組織中自噬相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物(LC3,Beclin-1等)以及神經(jīng)元損傷標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)的變化情況。結(jié)果顯示,加蘭他敏能有效抑制Aβ介導(dǎo)的LC3和Beclin-1等的表達(dá),并且加蘭他敏還能顯著抑制Aβ介導(dǎo)神經(jīng)元毒性損傷,即加蘭他敏抑制Aβ介導(dǎo)的NSE的表達(dá),結(jié)果表明加蘭他敏通過抑制Aβ介導(dǎo)的自噬起到神經(jīng)元保護(hù)作用。結(jié)論加蘭他敏通過抑制NOX4的表達(dá)進(jìn)而抑制ROS的累積最終抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷性自噬,對神經(jīng)元起到神經(jīng)保護(hù)作用,為更深層次解析加蘭他敏的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制和AD的病理進(jìn)程提供新的見解和思路。
【學(xué)位單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 王寵;張萍;朱衛(wèi)國;;細(xì)胞自噬與腫瘤發(fā)生的關(guān)系[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2010年11期

2 顧萍,金慶文,丁新生,王穎,李弘鈞;氫溴酸加蘭他敏治療阿爾海默病的療效觀察[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);2000年06期

3 金慶文,王穎,王興霞,李弘均,陳偉賢,侯熙德,吳瑞枝,葉勤;氫溴酸加蘭他敏膠囊改善老年及老年前期者記憶障礙的臨床觀察[J];腦與神經(jīng)疾病雜志;1997年03期

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1 孫月;不同程度過氧化氫通過線粒體ROS調(diào)控PC12細(xì)胞存活與死亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號：2822479