目的:采用藥物親和響應(yīng)目標(biāo)穩(wěn)定性方法鑒定神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)中7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并[a]芘(BPDE)的結(jié)合蛋白,并借助生物信息學(xué)分析的手段篩選與神經(jīng)毒性密切相關(guān)的靶蛋白,為進(jìn)一步研究苯并[a]芘(B[a]P)的神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供依據(jù)。方法:培養(yǎng)并收集人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y),提取蛋白并將裂解物的蛋白濃度調(diào)整為6g/L,等分為BPDE孵育組與DMSO溶劑對照組,分別與BPDE儲備液和等體積DMSO混勻,室溫孵育2h后,按比例加入嗜熱菌蛋白酶進(jìn)行消化,消化結(jié)束后一部分樣品用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白條帶并染色,其余樣品進(jìn)行LC-MS/MS檢測差異蛋白。對鑒定出的結(jié)合蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選出與神經(jīng)毒性密切相關(guān)的靶蛋白。采用蛋白質(zhì)印跡、細(xì)胞熱變化分析的方法驗(yàn)證蛋白與BPDE的結(jié)合作用。結(jié)果:SDS-PAGA電泳結(jié)果顯示BPDE孵育組與DMSO溶劑對照組之間的蛋白質(zhì)條帶沒有明顯差異。但添加嗜熱菌蛋白酶消化后,在BPDE孵育組與DMSO溶劑對照組之間出現(xiàn)肉眼可見的差異條帶。通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析共鑒定出472種蛋白質(zhì),其中有69種蛋白質(zhì)僅在DMSO溶劑對照組中出現(xiàn),298種蛋白質(zhì)僅在BPDE孵育組中出現(xiàn)。按照差異倍數(shù)2.0倍且P值0.05的標(biāo)準(zhǔn)(含僅在一組出現(xiàn)的蛋白),確定出428種結(jié)合蛋白,其中81.3%的結(jié)合蛋白在BPDE孵育組的含量顯著高于對照組。對428種結(jié)合蛋白進(jìn)行GO分析顯示,生物過程主要涉及細(xì)胞反應(yīng)及調(diào)控,其中注釋到蛋白數(shù)目最多的分類主要涉及大分子、有機(jī)氮、蛋白質(zhì)等代謝過程;細(xì)胞組分部分主要與細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),蛋白數(shù)目最多的分類主要涉及細(xì)胞器、囊泡、細(xì)胞外泌體等。分子功能主要涉及分子間的結(jié)合作用,主要包括蛋白結(jié)合、RNA結(jié)合等,其中蛋白數(shù)目最多的分類主要涉及核酸結(jié)合、核苷酸結(jié)合、酶結(jié)合等。通過KEGG分析顯示,涉及蛋白數(shù)目最多的分類為代謝與遺傳信息處理。P值最顯著的前10條KEGG信號通路為蛋白酶體、碳代謝、丙酮酸代謝、剪接體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、核糖體、RNA運(yùn)輸、氨�；�-tRNA生物合成、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、糖酵解/糖異生信號通路。主要涉及神經(jīng)細(xì)胞中的能量代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)的合成、溶酶體、核糖體以及遺傳信息處理方面。其他與神經(jīng)毒性相關(guān)的通路還主要包括與細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、長時(shí)程增強(qiáng)、cAMP信號通路、鈣信號通路和與修復(fù)相關(guān)的核苷酸切除修復(fù)、錯配修復(fù)、同源重組、基礎(chǔ)切除修復(fù)以及與突觸功能相關(guān)的突觸小泡循環(huán)、多巴胺能突觸、谷氨酸能突觸、5-羥色胺能突觸等。蛋白質(zhì)相互作用分析發(fā)現(xiàn),位于中心關(guān)鍵部位且聯(lián)系緊密的蛋白主要涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、神經(jīng)細(xì)胞能量代謝、突觸功能、神經(jīng)細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)及學(xué)習(xí)記憶,結(jié)合GO功能分析與KEGG通路分析,篩選確定出40S核糖體蛋白S21、AP-2復(fù)合亞基α-2、酪蛋白激酶I同種型δ、酪蛋白激酶I同種型ε、40S核糖體蛋白S5、ATP合酶亞基α、AP-2復(fù)合亞基α-1、40S核糖體蛋白S14、轉(zhuǎn)酮醇、紫外線切除修復(fù)蛋白RAD23A同系物A、40S核糖體蛋白S6、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3、谷氨酸受體離子型NMDAR2A、蘋果酸脫氫酶、60S核糖體蛋白L27、二氫硫辛酰脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、40S核糖體蛋白S2、網(wǎng)格蛋白重鏈、中性α-葡糖苷酶AB、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A65kDa調(diào)節(jié)亞基Aα同種型、40S核糖體蛋白S10、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A4、果糖二磷酸醛縮酶A、伸長因子2、60S核糖體蛋白L6、78kDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白等可能位于神經(jīng)毒性損傷相關(guān)信號通路關(guān)鍵點(diǎn)的26種蛋白為重點(diǎn)關(guān)注的BPDE靶蛋白。選擇NMDAR2A蛋白和RAD23A蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,當(dāng)不添加嗜熱菌蛋白酶消化時(shí),BPDE孵育組的NMDAR2A蛋白和RAD23A蛋白相對含量與DMSO溶劑對照相比均無顯著性差異;但在嗜熱菌蛋白酶消化后,BPDE孵育組中NMDAR2A蛋白和RAD23A蛋白相對含量均明顯高于DMSO溶劑對照組(P0.05)。細(xì)胞熱變換分析表明,NMDAR2A蛋白的ΔTm=(7.35±1.74)℃,RAD23A蛋白的ΔTm=(9.64±2.42)℃,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:BPDE結(jié)合可以改變結(jié)合蛋白對嗜熱菌蛋白酶消化的敏感性,藥物親和響應(yīng)目標(biāo)穩(wěn)定性方法可用于鑒定和篩選BPDE蛋白加合物。通過該方法共鑒定出可與BPDE結(jié)合的SH-SY5Y細(xì)胞蛋白428種,其中NMDAR2A、RAD23A等26種結(jié)合蛋白可能為BPDE神經(jīng)毒性有關(guān)的重要靶蛋白。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R99
【部分圖文】：

拼笱絀妒墾絎宦畚?0圖 1 靶蛋白鑒定及驗(yàn)證的工作流程圖1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用 SPSS22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以 x±s 表示，組間比較采用LSD法，蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行非標(biāo)記定量計(jì)算采用MaxQuant軟件中的 Labelfree 算法，其中檢測差異倍數(shù)大于 2.0 倍且 P 值<0.05 的蛋白質(zhì)與僅在其中一組檢測到的蛋白質(zhì)視為顯著性差異蛋白質(zhì)，即潛在靶點(diǎn)蛋白。GO 注釋的顯著性富集分析及 KEGG 通路富集分析通過 Fisher 確切概率法來評價(jià)。使用 GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行做圖。

2.1 DARTS 最佳實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化研究表明酶對蛋白質(zhì)的消化能力存在藥物濃度依賴性[28]，對于 BPDE 的給藥濃度，盡可能保證有過量的 BPDE 去結(jié)合靶點(diǎn)蛋白。對于嗜熱菌蛋白酶（Thermolysin）的比例，按照參考文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白：嗜熱菌蛋白酶=15：1 的比例進(jìn)行設(shè)定[28]，設(shè)置 5：1，10：1，15：1，20：1 的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探索。研究結(jié)果表明，嗜熱菌蛋白酶的最佳消化比例為蛋白：嗜熱菌蛋白酶=10：1，肉眼可見差異蛋白條帶，見圖 2所示。在 DARTS 實(shí)驗(yàn)中，要求采用溫和的裂解方式，盡可能保持蛋白原有的活性，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞裂解物與藥物孵育的過程中，要求靜置、避免劇烈震蕩，以免影響蛋白活性。電泳結(jié)束后，使用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行凝膠顏色。在無嗜熱菌蛋白酶消化的情況下，BPDE 孵育組與 DMSO 溶劑對照組相比，蛋白條帶未見明顯差異。在添加嗜熱菌蛋白酶消化的情況下，BPDE 孵育組與 DMSO 溶劑對照組之間出現(xiàn)肉眼可見的差異條帶。電泳結(jié)果見圖 3。

圖 3 嗜熱菌蛋白酶消化前后細(xì)胞裂解物 SDS-PAGE 凝膠電泳圖譜注：圖中箭頭標(biāo)注條帶為差異條帶。白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果axQuant 是領(lǐng)先的蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量算法，近年來已經(jīng)逐漸成內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)解決方案之一[36]。我們采用 MaxQuant 軟件中的 Labe組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行非標(biāo)記定量計(jì)算，在定量結(jié)果的顯著性差異分析.0 倍且 P 值<0.05 的蛋白質(zhì)視為顯著性差異蛋白質(zhì)。通過非標(biāo)析方法共鑒定出 472 種蛋白質(zhì)，其中 69 種蛋白僅在 DMSO 溶8 種蛋白僅在 BPDE 孵育組中出現(xiàn)，BPDE 孵育組和 DMSO 溶的蛋白質(zhì)有 105 種，其中 61 種存在顯著性差異，結(jié)果見圖 4-A質(zhì)中，最后確定存在顯著性差異的蛋白有 428 種，即潛在靶點(diǎn)

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