腹瀉是一種全球性疾病,在兒童當中發(fā)病率和死亡率都較高。腸道具有對電解質(zhì)離子和水的吸收分泌能力,其分泌和吸收功能的紊亂或吸收和分泌平衡被打破,會導致腹瀉。大量研究表明,分泌性腹瀉引起的腸道液體大量丟失是由于腸粘膜液體分泌過度和重吸收減少共同作用的結(jié)果。腹瀉病原毒素引發(fā)的氯離子向腸腔內(nèi)的主動轉(zhuǎn)運及其所驅(qū)動的鈉離子和水的被動轉(zhuǎn)運是腸道液體過度分泌的主要機制。氯離子向腸腔內(nèi)的大量分泌是通過激活腸粘膜上皮細胞頂質(zhì)膜上的氯離子通道實現(xiàn)的,而氯離子轉(zhuǎn)運的電化學驅(qū)動力來源于上皮細胞基底膜上鈉-鉀泵(Na+-K+ATPase)、鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運體(NKCC1)和鉀通道聯(lián)合介導的離子轉(zhuǎn)運。分泌性腹瀉機制中主要涉及兩種類型的氯離子通道:囊性纖維化跨膜電導調(diào)節(jié)因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)和鈣激活氯離子通道(Ca2+-activated chloride channels,CaCCs)。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白,CFTR作為腸道上皮細胞跨膜電解質(zhì)離子轉(zhuǎn)運中心在哺乳動物呼吸道和胃腸道粘膜等多種與分泌和吸收有關(guān)組織的上皮細胞廣泛表達,為氯離子跨上皮轉(zhuǎn)運提供了選擇性通道。在霍亂和旅行者腹瀉等由細菌毒素引起的純分泌性腹瀉中,細菌分泌的內(nèi)毒素主要激活上皮細胞頂質(zhì)膜上的CFTR氯離子通道。同時霍亂毒素和大腸桿菌內(nèi)毒素分別通過腺苷環(huán)化酶和鳥苷環(huán)化酶途徑影響CFTR蛋白調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的磷酸化引發(fā)通道持續(xù)開放和氯離子大量分泌并進而帶動Na+和水的轉(zhuǎn)運。在上述過程中細菌內(nèi)毒素介導的是純分泌性腹瀉,并不引起腸道結(jié)構(gòu)破壞,因此CFTR氯離子通道成為細菌性分泌性腹瀉的新分子靶標。鈣激活氯通道(Calcium-activated Chloride Channels,CaCCs)在非洲爪蟾卵母細胞中相繼發(fā)現(xiàn)和證實,直到2008年才報道了跨膜蛋白16A(transmembrane protein16A,TMEM16A)為鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ),鈣激活氯通道能夠被細胞內(nèi)增加的鈣離子濃度所激活。目前已發(fā)現(xiàn),在各種分泌上皮如唾液腺上皮和胃腸道細胞等TMEM16A蛋白均有表達。在輪狀病毒腹瀉,通常認為該病毒的一種非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4及其活性降解片段作為病毒分泌的內(nèi)毒素激活CaCCs氯離子通道。雖然詳細的細胞機制尚不清楚,一些證據(jù)表明NSP4可能通過直接升高細胞內(nèi)鈣離子濃度,也可能通過腸道神經(jīng)系統(tǒng)或整合素受體(Integrin receptor)和肝丙素受體(Galanin receptors)間接升高細胞內(nèi)鈣離子濃度從而激活CaCCs氯離子通道。另外,由于上皮細胞內(nèi)cAMP信號通路與Ca2+介導的信號通路之間存在一定的交擾(Crosstalk),也不能排除CFTR氯離子通道在輪狀病毒腹瀉中有一定的作用。尼莫地平是生物堿類化合物,具有很多重要的藥理價值。尼莫地平屬雙氫吡啶類鈣拮抗劑,主要是通過作用于肌細胞膜L型鈣通道阻遏外源鈣離子內(nèi)流降低細胞內(nèi)鈣離子濃度從而達到舒張血管的作用,它可以很容易通過血腦屏障而作用于腦血管及神經(jīng)細胞,但其確切的作用機制仍然不是很清楚。尼莫地平作為鈣離子的拮抗劑在改善腦缺血和腦血管痙攣方面、對癌細胞系的抑制作用方面、在神經(jīng)系統(tǒng)和記憶方面等都發(fā)揮著重要的作用。本研究利用細胞熒光淬滅模型測定了尼莫地平對野生型CFTR(wt-CFTR)Cl-通道的激活活性;同時利用細胞熒光淬滅模型測定了尼莫地平對CaCCs Cl-通道的抑制活性。利用短路電流技術(shù)對尼莫地平激起大鼠結(jié)腸粘膜CFTR短路電流進行了分析;利用短路電流技術(shù)分析了尼莫地平對大鼠結(jié)腸粘膜激起的CaCCs短路電流。小鼠腸道閉環(huán)實驗研究了尼莫地平對小鼠腸道液體分泌的影響。熒光淬滅實驗結(jié)果顯示尼莫地平能夠以劑量依賴的方式激活CFTR氯離子通道,其對Cl-的轉(zhuǎn)運活性具有迅速、可逆的特點,這種激活作用能被CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172和GlyH101全部抑制,同時尼莫地平對CFTR的激活具有FSK依賴性。CaCCs Cl-通道熒光淬滅實驗結(jié)果顯示尼莫地平能夠以劑量依賴的方式抑制由ATP激活的CaCCs Cl-通道,且對CaCCs Cl-通道的抑制具有可逆性。CFTR大鼠粘膜短路電流實驗揭示尼莫地平可以激活大鼠結(jié)腸漿膜側(cè)CFTR電流,而對黏膜側(cè)短路電流基本沒影響。CaCCs大鼠粘膜短路電流實驗揭示尼莫地平可以抑制由卡巴膽堿激活的CaCCs短路電流,當提供無鈣離子的KH液時尼莫地平對CaCCs基本無抑制作用。小鼠腸道閉環(huán)實驗結(jié)果說明尼莫地平能促進小鼠腸道液體分泌。本實驗研究了尼莫地平對CFTR和CaCCs Cl-通道的調(diào)節(jié)作用,發(fā)現(xiàn)了尼莫地平的新活性。同時揭示了尼莫地平作為降高血壓藥的降壓作用可能機制及其用藥產(chǎn)生腹瀉等副作用的可能原因,為用藥提供了一定注意事項。以上結(jié)果也提示CFTR和CaCCs作為尼莫地平的分子靶標,尼莫地平可以為研發(fā)治療CFTR和CaCCs的相關(guān)疾病的新藥奠定了理論基礎(chǔ)。
【學位單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R96

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本文編號：2821494