腹瀉是一種全球性疾病,在兒童當(dāng)中發(fā)病率和死亡率都較高。腸道具有對(duì)電解質(zhì)離子和水的吸收分泌能力,其分泌和吸收功能的紊亂或吸收和分泌平衡被打破,會(huì)導(dǎo)致腹瀉。大量研究表明,分泌性腹瀉引起的腸道液體大量丟失是由于腸粘膜液體分泌過(guò)度和重吸收減少共同作用的結(jié)果。腹瀉病原毒素引發(fā)的氯離子向腸腔內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)及其所驅(qū)動(dòng)的鈉離子和水的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是腸道液體過(guò)度分泌的主要機(jī)制。氯離子向腸腔內(nèi)的大量分泌是通過(guò)激活腸粘膜上皮細(xì)胞頂質(zhì)膜上的氯離子通道實(shí)現(xiàn)的,而氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)的電化學(xué)驅(qū)動(dòng)力來(lái)源于上皮細(xì)胞基底膜上鈉-鉀泵(Na+-K+ATPase)、鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(NKCC1)和鉀通道聯(lián)合介導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。分泌性腹瀉機(jī)制中主要涉及兩種類型的氯離子通道:囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)和鈣激活氯離子通道(Ca2+-activated chloride channels,CaCCs)。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白,CFTR作為腸道上皮細(xì)胞跨膜電解質(zhì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)中心在哺乳動(dòng)物呼吸道和胃腸道粘膜等多種與分泌和吸收有關(guān)組織的上皮細(xì)胞廣泛表達(dá),為氯離子跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)提供了選擇性通道。在霍亂和旅行者腹瀉等由細(xì)菌毒素引起的純分泌性腹瀉中,細(xì)菌分泌的內(nèi)毒素主要激活上皮細(xì)胞頂質(zhì)膜上的CFTR氯離子通道。同時(shí)霍亂毒素和大腸桿菌內(nèi)毒素分別通過(guò)腺苷環(huán)化酶和鳥(niǎo)苷環(huán)化酶途徑影響CFTR蛋白調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的磷酸化引發(fā)通道持續(xù)開(kāi)放和氯離子大量分泌并進(jìn)而帶動(dòng)Na+和水的轉(zhuǎn)運(yùn)。在上述過(guò)程中細(xì)菌內(nèi)毒素介導(dǎo)的是純分泌性腹瀉,并不引起腸道結(jié)構(gòu)破壞,因此CFTR氯離子通道成為細(xì)菌性分泌性腹瀉的新分子靶標(biāo)。鈣激活氯通道(Calcium-activated Chloride Channels,CaCCs)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中相繼發(fā)現(xiàn)和證實(shí),直到2008年才報(bào)道了跨膜蛋白16A(transmembrane protein16A,TMEM16A)為鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ),鈣激活氯通道能夠被細(xì)胞內(nèi)增加的鈣離子濃度所激活。目前已發(fā)現(xiàn),在各種分泌上皮如唾液腺上皮和胃腸道細(xì)胞等TMEM16A蛋白均有表達(dá)。在輪狀病毒腹瀉,通常認(rèn)為該病毒的一種非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4及其活性降解片段作為病毒分泌的內(nèi)毒素激活CaCCs氯離子通道。雖然詳細(xì)的細(xì)胞機(jī)制尚不清楚,一些證據(jù)表明NSP4可能通過(guò)直接升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,也可能通過(guò)腸道神經(jīng)系統(tǒng)或整合素受體(Integrin receptor)和肝丙素受體(Galanin receptors)間接升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度從而激活CaCCs氯離子通道。另外,由于上皮細(xì)胞內(nèi)cAMP信號(hào)通路與Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路之間存在一定的交擾(Crosstalk),也不能排除CFTR氯離子通道在輪狀病毒腹瀉中有一定的作用。尼莫地平是生物堿類化合物,具有很多重要的藥理價(jià)值。尼莫地平屬雙氫吡啶類鈣拮抗劑,主要是通過(guò)作用于肌細(xì)胞膜L型鈣通道阻遏外源鈣離子內(nèi)流降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度從而達(dá)到舒張血管的作用,它可以很容易通過(guò)血腦屏障而作用于腦血管及神經(jīng)細(xì)胞,但其確切的作用機(jī)制仍然不是很清楚。尼莫地平作為鈣離子的拮抗劑在改善腦缺血和腦血管痙攣方面、對(duì)癌細(xì)胞系的抑制作用方面、在神經(jīng)系統(tǒng)和記憶方面等都發(fā)揮著重要的作用。本研究利用細(xì)胞熒光淬滅模型測(cè)定了尼莫地平對(duì)野生型CFTR(wt-CFTR)Cl-通道的激活活性;同時(shí)利用細(xì)胞熒光淬滅模型測(cè)定了尼莫地平對(duì)CaCCs Cl-通道的抑制活性。利用短路電流技術(shù)對(duì)尼莫地平激起大鼠結(jié)腸粘膜CFTR短路電流進(jìn)行了分析;利用短路電流技術(shù)分析了尼莫地平對(duì)大鼠結(jié)腸粘膜激起的CaCCs短路電流。小鼠腸道閉環(huán)實(shí)驗(yàn)研究了尼莫地平對(duì)小鼠腸道液體分泌的影響。熒光淬滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尼莫地平能夠以劑量依賴的方式激活CFTR氯離子通道,其對(duì)Cl-的轉(zhuǎn)運(yùn)活性具有迅速、可逆的特點(diǎn),這種激活作用能被CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172和GlyH101全部抑制,同時(shí)尼莫地平對(duì)CFTR的激活具有FSK依賴性。CaCCs Cl-通道熒光淬滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尼莫地平能夠以劑量依賴的方式抑制由ATP激活的CaCCs Cl-通道,且對(duì)CaCCs Cl-通道的抑制具有可逆性。CFTR大鼠粘膜短路電流實(shí)驗(yàn)揭示尼莫地平可以激活大鼠結(jié)腸漿膜側(cè)CFTR電流,而對(duì)黏膜側(cè)短路電流基本沒(méi)影響。CaCCs大鼠粘膜短路電流實(shí)驗(yàn)揭示尼莫地平可以抑制由卡巴膽堿激活的CaCCs短路電流,當(dāng)提供無(wú)鈣離子的KH液時(shí)尼莫地平對(duì)CaCCs基本無(wú)抑制作用。小鼠腸道閉環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明尼莫地平能促進(jìn)小鼠腸道液體分泌。本實(shí)驗(yàn)研究了尼莫地平對(duì)CFTR和CaCCs Cl-通道的調(diào)節(jié)作用,發(fā)現(xiàn)了尼莫地平的新活性。同時(shí)揭示了尼莫地平作為降高血壓藥的降壓作用可能機(jī)制及其用藥產(chǎn)生腹瀉等副作用的可能原因,為用藥提供了一定注意事項(xiàng)。以上結(jié)果也提示CFTR和CaCCs作為尼莫地平的分子靶標(biāo),尼莫地平可以為研發(fā)治療CFTR和CaCCs的相關(guān)疾病的新藥奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R96

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本文編號(hào)：2821494