目的表皮生長(zhǎng)因子受體(Epithelial growth factor receptor,EGFR)是一種具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞膜表面蛋白,通過(guò)與配體結(jié)合來(lái)激活。研究表明,它在大多數(shù)癌癥患者中高表達(dá),并且表達(dá)異常的EGFR信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展,侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。吉非替尼(gefitinib)是一種常見(jiàn)的對(duì)EGFR起作用的酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors,TKI,EGFR-TKI),它可以有效預(yù)防實(shí)體瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。EGFR-TKI通常在惡性腫瘤的治療中是成功的,特別是對(duì)于非小細(xì)胞肺癌,然而,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的藥物治療后,腫瘤細(xì)胞變得對(duì)其并不敏感,治療效果顯著下降,這一現(xiàn)象被稱為獲得性耐藥。因?yàn)楂@得性耐藥的產(chǎn)生,所以顯著降低了EGFR-TKI的治療效果并限制其臨床應(yīng)用。目前對(duì)于臨床上如何克服腫瘤患者對(duì)EGFR-TKI的耐藥性還缺乏有效的治療策略,通過(guò)前期研究我們發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株的多藥耐藥蛋白(multidrug resistance 1 gene,MDR1)和自噬水平明顯升高,這些結(jié)果表明MDR1蛋白和細(xì)胞自噬可能在EGFR獲得性耐藥中發(fā)揮重要的作用。用特異性抗體封閉MDR1并降低其自噬水平可以明顯增強(qiáng)耐藥性腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的敏感性。本研究擬將生物學(xué)的技術(shù)方法和納米技術(shù)結(jié)合,選擇SMMC-7721/geftinib細(xì)胞作為體外研究的細(xì)胞模型,通過(guò)構(gòu)建MDR1單克隆抗體(monoclonal antibody against MDR1,mAb MDR1)修飾的殼聚糖納米粒(nanoparticles,NPs),內(nèi)部包裹gefitinib和自噬抑制物氯喹(chloroquine,CQ),在細(xì)胞水平檢測(cè)SMMC-7721/gefitinib細(xì)胞對(duì)抗體修飾納米粒的敏感性,探討MDR1和自噬雙重靶向的納米粒逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥的可能性及其分子機(jī)制。方法本研究首先建立了gefitinib和CQ含量的UV測(cè)定方法。以gefitinib、CQ、殼聚糖(Chitosan,CS)、多聚磷酸鈉(Sodium polyphosphate,TPP)為原料,應(yīng)用離子交聯(lián)法制備共載gefitinib和CQ的殼聚糖納米粒(gefitinib/CQ NPs),通過(guò)正負(fù)電荷互相吸引的作用將mAb MDR1修飾到其表面,制備gefitinib和CQ聯(lián)合給藥的MDR1抗體修飾殼聚糖納米粒(gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs),通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選制備gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs的最優(yōu)處方,并考察了納米粒的形態(tài)、粒徑、Zeta電位、包封率等理化參數(shù)以及納米粒的體外藥物釋放模式。利用激光共聚焦顯微鏡觀察了耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)裝載羅丹明B(Rhodamine B,RhoB)熒光染料的mAb MDR1修飾的殼聚糖納米粒(mAb MDR1-NPs)的攝取情況,評(píng)估了抗體修飾后納米粒的靶向性,通過(guò)內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的攝取機(jī)制進(jìn)行了一定的探索。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)以及流式細(xì)胞凋亡技術(shù)檢測(cè)了gefitinib、gefitinib+mAb MDR1、gefitinib+CQ、gefitinib+mAb MDR1+CQ、gefitinib NPs、gefitinib/CQ NPs、gefitinib mAb MDR1-NPs、gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs對(duì)SMMC-7721/gefitinib細(xì)胞增殖及凋亡的影響,最后應(yīng)用western blot方法檢測(cè)了藥物作用后的細(xì)胞中bax、cleaved caspase 3、cleaved PARP、LC3、MDR1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果本研究建立的gefitinib和CQ的UV定量分析方法的線性、精密度和回收率等均符合測(cè)定要求,可以用于兩種藥物體外含量測(cè)定。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選出了制備gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs的最優(yōu)處方,且制得的納米粒結(jié)構(gòu)完整,為規(guī)則的球形,分散性良好,粒徑較為均勻。Gefitinib/CQ NPs、gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs中g(shù)efitinib和CQ的體外釋放行為沒(méi)有顯著差別,呈現(xiàn)雙相釋放模式。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察了SMMC-7721/gefitinib細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取過(guò)程,發(fā)現(xiàn)其具有時(shí)間依賴性,mAb MDR1-NPs有效地增強(qiáng)了MDR1過(guò)表達(dá)SMMC-7721/gefitinib細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取。內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小窩蛋白和胞飲作用是細(xì)胞對(duì)納米粒內(nèi)吞的主要途徑,并且具有能量依賴性。MTT和流式細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs可顯著抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡。Western blot結(jié)果顯示,gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs處理耐藥細(xì)胞后,SMMC-7721/gefitinib細(xì)胞的bax、cleaved caspase3、cleaved PARP蛋白表達(dá)水平明顯升高,LC3和MDR1的表達(dá)水平下降,說(shuō)明CQ和mAb MDR1可以協(xié)同促進(jìn)gefitinib的抗腫瘤作用。結(jié)論Gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs可以逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI獲得性耐藥,通過(guò)調(diào)控自噬和封閉MDR1的活性,增強(qiáng)抗腫瘤藥物的攝取,顯著的促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這表明在SMMC-7721/geftinib細(xì)胞中,自噬和MDR1可能是克服獲得性耐藥兩個(gè)作用靶點(diǎn),因此,聯(lián)合抑制自噬和MDR1的臨床應(yīng)用可能是克服獲得性EGFR-TKI耐藥的重要策略之一。
【學(xué)位單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943;R96
【部分圖文】：

果如圖 2-1 所示，gefitinib 溶液在 252 nm 處有最大紫外吸收峰，而 CDR1 混合溶液在此波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收峰，由此確定 gefitinib 的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2-2a CQ 溶液，2-2b CS 和 mAb MDR1 混合溶液的紫外光譜掃描圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立1）Gefitinib 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立 gefitinib 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成不同濃度，以濃度 C 為 X 軸，吸光度 A

gefitinib溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

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本文編號(hào)：2821450