紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是一種從裸子植物紅豆杉的樹皮分離提純所得的天然次生代謝產(chǎn)物,作為一線抗腫瘤天然藥物,目前已廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤的臨床治療。紫杉醇類藥物(包括其衍生物多烯紫杉醇和卡巴紫杉醇)是目前唯一臨床應(yīng)用微管蛋白聚合劑,其抗腫瘤機(jī)制獨特,通過誘導(dǎo)微管蛋白聚合并抑制其解聚,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過程被固定在G2/M期,從而使腫瘤細(xì)胞無法完成有絲分裂過程而死亡。然而,紫杉醇水溶性極差,口服給藥生物利用度低,依從性差,臨床必須使用毒性增溶劑將藥物溶解后進(jìn)行注射給藥,導(dǎo)致患者不良反應(yīng)發(fā)生率較高,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。紫杉醇制劑水溶性和腫瘤組織選擇性的缺乏是影響藥物使用和發(fā)揮療效的兩大關(guān)鍵問題。目前,除了傳統(tǒng)溶劑型的紫杉醇注射液外,臨床還有人血白蛋白型紫杉醇和紫杉醇脂質(zhì)體得以應(yīng)用,此兩者均可改善紫杉醇的溶解性能,在保持藥理活性的基礎(chǔ)上減少毒性增溶劑的用量,降低患者不良反應(yīng)的發(fā)生率。然而,此二者制備工藝復(fù)雜,工藝成本較高,導(dǎo)致價格長期居高不下且一直未被納入國家醫(yī)保目錄,臨床治療成本極高,對患者造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,傳統(tǒng)溶劑型的紫杉醇注射液仍然是我國目前市場份額最大的紫杉醇制劑。近年,學(xué)界提出了通過糖基化修飾提高紫杉醇溶解性的策略,雖然相關(guān)研究得到一定程度的推進(jìn),但目前研究大多為關(guān)于糖綴合物溶解性、親水性等理化性質(zhì)的探索,紫杉醇糖綴合物與腫瘤細(xì)胞相互作用的機(jī)制研究報道較少。異常提高的葡萄糖代謝是腫瘤細(xì)胞最明顯的生理學(xué)特性之一,為了攝取更多的葡萄糖,腫瘤細(xì)胞表面葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(GLUT-1)的表達(dá)水平會出現(xiàn)異常上調(diào),抑制GLUT-1表達(dá)可以抑制腫瘤的增殖和侵襲。據(jù)此,本文提出對紫杉醇進(jìn)行糖基化修飾的策略,一方面,紫杉醇的糖綴合物能夠通過與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白互相作用的機(jī)制,提高腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取,發(fā)揮藥物的腫瘤細(xì)胞靶向作用;另一方面,強親水性基團(tuán)的修飾能提高藥物的水溶性。由此,本文設(shè)計并合成了紫杉醇不同位點修飾的葡萄糖綴合物TXGDs,包括C-13側(cè)鏈2'-OH單位點取代的葡萄糖綴合物TXGD-A、C-13側(cè)鏈2'-OH與巴卡亭母核7-OH同時進(jìn)行修飾的雙位點取代葡萄糖綴合物TXGD-B,兩種綴合物均以丁二酸酯作為連接臂。其后,本文對合成的TXGDs進(jìn)行了體外抗腫瘤活性、抗腫瘤機(jī)制、TXGD-A與GLUT-1互作結(jié)合程度及腫瘤細(xì)胞攝取率的測定,最后進(jìn)行溶解度、脂水分配/分布系數(shù)等方面的研究。結(jié)果顯示,TXGD-A表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性且可實現(xiàn)與GLUT-1的互作結(jié)合,通過該機(jī)制提高腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取,提示TXGD-A可能具備作為PTX衍生物進(jìn)行二次開發(fā)的潛力,各項研究結(jié)果大致羅列如下:本文首先合成了兩種紫杉醇的葡萄糖綴合物TXGDs,包括單位點取代綴合物TXGD-A與雙位點取代綴合物TXGD-B,其中TXGD-A修飾位點為側(cè)鏈2,-OH,TXGD-B的紫杉醇修飾位點為側(cè)鏈2'-OH和巴卡亭母核7-OH,葡萄糖環(huán)的修飾位點均為C-1上羥基,連接臂均為丁二酸酯,經(jīng)1H NMR、13C NMR及HRMS表征后可判斷目標(biāo)產(chǎn)物已成功合成。其后,本文對TXGDs進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測定,體外腫瘤細(xì)胞抑制作用測試結(jié)果顯示,雖然TXGDs對人乳腺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的抑制作用弱于本體藥物PTX,但抑制作用依然明顯且IC0G可維持在nM量級。TXGD-A對人乳腺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的IC50值分別為148.75 nM和1077.15 nM,均低于TXGD-B,提示單位點取代的PTX葡萄糖綴合物體外對腫瘤細(xì)胞的抑制作用強于雙位點取代的PTX葡萄糖綴合物;促腫瘤細(xì)胞凋亡測試結(jié)果顯示TXGD-A作用于人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞后,有21.23%的腫瘤細(xì)胞處于凋亡狀態(tài),其誘導(dǎo)凋亡作用明顯強于TXGD-B,提示單位點取代的葡萄糖綴合物體外對腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用強于雙位點取代的葡萄糖綴合物;TXGDs對人正常乳腺上皮細(xì)胞的抑制作用弱于本體藥物PTX,提示PTX經(jīng)糖基化策略修飾后不會對正常細(xì)胞造成額外的毒性;微管蛋白動力學(xué)測定結(jié)果顯示TXGDs均具備明顯的促微管蛋白聚合作用,各劑量TXGDs給藥組的OD值均明顯大于空白對照組,提示糖基化策略可保持PTX的抗腫瘤機(jī)制,不同濃度單位點取代的PTX葡萄糖綴合物體外對微管蛋白聚合的促進(jìn)作用均強于同濃度雙位點取代的PTX葡萄糖綴合物,不同濃度TXGD-A給藥組的OD值可提升至0.391-0.507,明顯高于同濃度的TXGD-B。綜合腫瘤細(xì)胞活力抑制作用、促腫瘤細(xì)胞凋亡作用、促微管蛋白聚合作用等多種參數(shù)可知,TXGD-A具備更明顯的體外抗腫瘤活性,可能擁有更優(yōu)越的進(jìn)行藥物開發(fā)的潛力;腫瘤細(xì)胞糖代謝活性顯著強于正常細(xì)胞但其代謝效率極差,其降低的糖酵解速率需要通過大量的葡萄糖攝取以進(jìn)行補償,故腫瘤細(xì)胞存在葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-1過表達(dá)的生理學(xué)特征。與被動轉(zhuǎn)運的細(xì)胞攝取行為相比,轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的細(xì)胞攝取特異性更強,攝取率更高,因此,GLUT-1可能是一個潛在的抗腫瘤治療靶點。由此,本文對TXGD-A進(jìn)行了與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-1互作程度及其腫瘤細(xì)胞攝取率的測定。首先,本文使用SPRi測定TXGD-A與GLUT-1的相互作用,結(jié)果顯示,TXGD-A可與GLUT-1結(jié)合形成復(fù)合物,其解離結(jié)合常數(shù)Avg Kd為3.76e-6且在不同蛋白濃度環(huán)境下其互作程度均極明顯優(yōu)于本體藥物PTX(PTX的Avg Kd為2.65e-5),提示PTX經(jīng)糖基化修飾后可實現(xiàn)藥物與GLUT-1的互作結(jié)合;激光共聚焦顯微鏡觀察TXGD-A和PTX給藥后在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的定位,結(jié)果顯示TXGD-A和PTX均可被腫瘤細(xì)胞攝取至細(xì)胞內(nèi)部且大多定位于細(xì)胞質(zhì)中,TXGD-A的熒光面積大于PTX,提示從形態(tài)學(xué)觀察,腫瘤細(xì)胞對TXGD-A的攝取程度高于PTX;攝取率測定結(jié)果顯示,與本體藥物PTX相比,人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對TXGD-A的攝取高于PTX,給藥24 h后,細(xì)胞對TXGD-A的攝取率可達(dá)35.03%,明顯高于PTX。為了研究腫瘤細(xì)胞對TXGD-A的攝取率是否與GLUT-1的表達(dá)水平相關(guān),本文對細(xì)胞進(jìn)行了 GLUT-1表達(dá)水平調(diào)控后測定細(xì)胞對TXGD-A的攝取率,結(jié)果顯示細(xì)胞對TXGD-A的攝取率受GLUT-1表達(dá)水平影響,細(xì)胞GLUT-1表達(dá)水平上/下調(diào)后,TXGD-A攝取率可升/降至60.52%/14.85%;計算機(jī)模擬計算TXGD-A與GLUT-1的結(jié)合位點,其主要結(jié)合位點可能是GLUT-1第161位的谷氨酰胺殘基(GLN161)和第380位的谷氨酸殘基(GLU380),結(jié)合方式為氫鍵作用。此外,本文還對合成的TXGDs進(jìn)行了多種理化性質(zhì)的測定。結(jié)果顯示,TXGDs在純水及不同的臨床使用注射介質(zhì)中的溶解度均明顯優(yōu)于PTX,TXGD-A 在純水和臨床用注射介質(zhì)中的溶解度可達(dá)本體藥物PTX的44.6-49.8倍;TXGD-B在三種介質(zhì)中的溶解度可提升至本體藥物PTX的86.9-97.4倍,顯示糖基化策略可明顯提高PTX的溶解性能;TXGDs均顯示出低于PTX的脂水分配/分布系數(shù),PTX經(jīng)糖基化修飾后,其脂水分配/分布系數(shù)Log P與Log D均降至0-3范圍內(nèi),處于較為合理的成藥范圍,顯示糖基化策略可明顯提高PTX的親水性,使其更適于新藥開發(fā);TXGDs在胎牛血清和兔血清中均可部分釋放出本體藥物PTX,二者比較可知,TXGD-A在24 h后在胎牛血清和兔血清中分別可釋放出17.57%與17.87%的PTX,其PTX釋放率高于TXGD-B;TXGDs的藥物設(shè)計參數(shù)計算結(jié)果表明PTX經(jīng)糖基化修飾后,其藥物設(shè)計參數(shù)可得到一定優(yōu)化。從契合質(zhì)量考慮,TXGD-A和TXGD-B針對人乳腺癌細(xì)胞的配體-受體契合質(zhì)量FQ分別可提升至0.225和0.246,針對人卵巢癌細(xì)胞的FQ則分別提升至0.314與0.296,均優(yōu)于本體藥物PTX。從親脂性和配體的親和力考慮,TXGD-A與TXGD-B針對人乳腺癌細(xì)胞的親脂性配體效率LELP分別可降低至72.860和57.144,針對人卵巢癌細(xì)胞的LELP則分別降至52.200與47.616,亦優(yōu)于本體藥物PTX;TXGD-A在純水及臨床用注射介質(zhì)中的溶解度受pH影響,其溶解度在pH 9-10環(huán)境中得到提升,但在pH 1-8的環(huán)境中可保持在約16-20 μg/mL區(qū)間,并不出現(xiàn)明顯波動,提示TXGD-A在人體內(nèi)不會因為不同組織內(nèi)環(huán)境pH不同導(dǎo)致藥物在體內(nèi)組織中出現(xiàn)濃度的異常波動;溶劑系統(tǒng)篩選結(jié)果指出,TXGD-A的溶解度在無酒精的低Cremophor EL比例增溶系統(tǒng)中具備良好的溶解性能,在Cremophor EL比例2.5%的無酒精溶劑系統(tǒng)中溶解度可達(dá)806.67 μg/mL,提示TXGD-A在潛在臨床應(yīng)用中可降低毒性增溶劑的使用比例,降低患者因增溶劑毒性出現(xiàn)不良反應(yīng)的概率,顯示出一定的臨床開發(fā)應(yīng)用價值。綜上所述,糖基化策略可改善PTX溶解度、親水性及藥物設(shè)計參數(shù)等多種不足,是一種可行的PTX修飾策略。TXGD-A既能加強PTX與GLUT-1的互作結(jié)合,從而促使腫瘤細(xì)胞對藥物進(jìn)行攝取,又能有效降低溶劑中毒性增溶劑的用量,提示PTX經(jīng)糖基化修飾后可借助GLUT-1的轉(zhuǎn)運作用增加腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取,TXGD-A具有作為PTX衍生物進(jìn)行二次開發(fā)的前景。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R914;R730.5
【部分圖文】：

邐糖基化紫杉酵的合成及其ＧＬＵＴ－１互作的腫瘤細(xì)胞靶向機(jī)制研究邐逡逑２．２實驗方法與結(jié)果逡逑２．邋２．邋１邋ＴＸＧＤ－Ａ的合成逡逑２．２．１．１邐ＴＸＧＤ－Ａ的合成路線逡逑ＴＸＧＤ－Ａ邋（ＰＴＸ邋２’－０Ｈ葡萄糖綴合物）的合成主要通過對ＰＴＸ結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈２’－０Ｈ逡逑進(jìn)行酯化反應(yīng)而實現(xiàn)。其步驟為（１）取芐基保護(hù)的葡萄糖與丁二酸酐反應(yīng)，使丁二逡逑酸酐開環(huán)以實現(xiàn)丁二酸酯連接臂的芐基葡萄糖化，得中間產(chǎn)物Ａ１；邋（２）取中間產(chǎn)物逡逑Ａ１與ＰＴＸ反應(yīng)，將芐基葡萄糖結(jié)構(gòu)通過酯化反應(yīng)以丁二酸酯為連接臂與ＰＴＸ結(jié)構(gòu)連逡逑接，得中間產(chǎn)物Ａ２；邋（３）取中間產(chǎn)物Ａ２進(jìn)行氫化反應(yīng)脫去芐基，得終產(chǎn)物ＴＸＧＤ－Ａ。逡逑ＴＸＧＤ－Ａ的合成路線見圖１：逡逑

度ＩＣ５Ｑ，測定波長４９０ｎｍ，細(xì)胞存活率％邋＝加藥組ＯＤ值／空白對照組ＯＤ值＊１００％。逡逑３．邋２．邋３結(jié)果逡逑ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細(xì)胞活力抑制作用測定結(jié)果見表１與圖３：逡逑２４逡逑

逡逑Ａ２７８０細(xì)胞活力抑制作用測定結(jié)果見表２與圖４：逡逑表２．邋ＰＴＸ及其葡萄糖綴合物；［乍用于卵巢癌細(xì)胞Ａ２７８０后細(xì)胞活力測定逡逑（％，邋；邋±邋ｓ，邋ｎ邋＝邋５－６邋）逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．邋Ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋Ａ２７８０邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＰＴＸ邋ａｎｄ邋ＴＸＧＤｓ逡逑（％，ｘ邋土邋ｓ，邋ｎ邋＝邋５－６邋）逡逑濃度／ｎＭ邐５邐２５邐１００邐５００邐１０００邐２０００逡逑ＰＴＸ邐８９．４２±邋１０．２１邐５８．９７±４．６９邐５０．９１±２．９３邐４８．０２±４．６９邐３４．１９±３．０５邐２８．５８±３．６２逡逑ＴＸＧＤ－Ａ邐１１４．８９±邋１５．５０邐１０７．１３±１６．０２＊＊邐８１．２９±８．５０＊＊邐６４．１６±５．９２＊邐４６．１８±邋１０．３４＊邐４２．３５±４．１０＊＊逡逑ＴＸＧＤ－Ｂ邐１１２．４３±邋１９．４４邐１１６．９２±９．７５＊＊邐１０６．２７±９．５８＊＊ｗ邐９６．９９±１０．０３＊＊ｗ邐５７．９５士邋１１．３９＂邐４６．４４±１１．６５＊逡逑ＴＸＧＤ－Ｃ邐１０９．５８±２０．４８邐１１３．３８±２３．９１＊＊邐６５．２１±８．０４＊＊＃＃＋＋邐６１．７２ｉｌ６．６０Ｍ邐５１．９３±８．３邋廣邐４４．３２±６．２６＊＊逡逑Ｆ邋值邐２．７４２邐１９．７５３邐５６．９６９邐２３．８９４邐７．８１１邐８．０８２逡逑尸值邐０．０７２邐０．０００邐０．０００邐０．０００邐０．００１邐０．００１逡逑注：與邋ＰＴＸ邋組比較

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本文編號：2814489