研究目的:胰島β細胞死亡是1型糖尿病的主要原因,也是2型糖尿病β細胞減少的關鍵因素。1型和2型糖尿病的特征是胰島素分泌受損和高血糖。雖然可以通過藥物控制高血糖,但這些藥物都無法靶向內源性β細胞阻止疾病進展。目前,維持內源性胰島β細胞數(shù)量及功能是調控高血糖的研究熱點之一,但其分子機制仍未完全闡明。因此,深入研究β細胞凋亡的分子機制,并從中發(fā)現(xiàn)可干預的靶點,有望為臨床血糖調控提供指導并推動新型靶向抗高血糖藥物的研發(fā)。信號轉導與轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)與細胞存活、增殖、分化和凋亡密切相關,影響機體各項生命活動。STAT3研究主要集中在免疫調控和腫瘤惡性進展,但與代謝相關疾病的關系同樣備受關注。肝細胞、下丘腦神經(jīng)元、脂肪組織T淋巴細胞和骨骼肌細胞中的STAT3作為關鍵調控因子,影響糖代謝及胰島素信號通路。因此,STAT3很可能與β細胞凋亡密切相關,其關系有待闡明。本課題主要研究STAT3通過PTEN調控β細胞凋亡影響高血糖進程的分子調控機制,以及靶向PTEN治療高血糖的作用研究。第一部分STAT3在β細胞損傷中的作用研究研究方法:本研究分別采用大鼠胰島細胞瘤細胞株INS-1細胞、小鼠原代胰島細胞、STZ誘導的高血糖小鼠模型和HFD誘導的肥胖小鼠模型評價STAT3在β細胞損傷中的作用。(1)采用Western blotting和Immunohistochemistry法考察不同β細胞損傷模型中STAT3的活性變化;(2)構建β細胞中STAT3特異性敲除小鼠;(3)OGTT和ITT法考察STZ/HFD誘導對β-STAT3KO小鼠β細胞功能的影響;(4)Immunofluorescence 和 Immunohistochemistry法考察不同模型β-STAT3KO小鼠胰島結構和β細胞功能;(5)通過siRNA技術干擾STAT3的表達,通過Western blotting和Immunofluorescence檢測INS-1細胞凋亡和增殖;(6)通過Western blotting和Immunofluorescence檢測同窩野生型和β-STAT3KO小鼠β細胞凋亡和增殖;(7)熒光定量PCR技術檢測β細胞相關轉錄因子變化;(8)采用流式細胞術和HE染色考察炎性細胞浸潤情況。研究結果:(1)β細胞損傷對STAT3活性的影響給予不同化合物(葡萄糖、STZ和H202)刺激INS-1細胞,結果顯示細胞損傷影響STAT3激活,且損傷程度與pSTAT3表達呈負相關;STZ大劑量單次誘導C57BL/6J雄鼠形成高血糖,結果顯示高血糖進展與β細胞中pSTAT3表達呈負相關;高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6J雄鼠16周,小鼠胰島中STAT3和pSTAT3均無明顯變化。(2)STAT3特異性敲除對高脂飼料誘導的肥胖小鼠的影響β-STAT3KO小鼠成功構建,并且存在肥胖表型;高脂飼料喂養(yǎng)16周后,野生型小鼠與β-STAT3KO小鼠血糖略有升高,糖耐量曲線輕微上移,β細胞均發(fā)生代償性增殖,胰島結構正常,但兩組小鼠間無明顯差異。(3)STAT3特異性敲除對STZ誘導的高血糖小鼠的影響β-STAT3KO小鼠對STZ 40mg/kg連續(xù)3天造模更敏感,易形成高血糖,而β-STAT3KO小鼠STZ 150 mg/kg單次造模后與野生型小鼠幾乎無差異,均表現(xiàn)為高血糖;與同窩野生型小鼠相比,STZ誘導的β-STAT3KO小鼠表現(xiàn)為體重減輕,口服糖耐受不良,胰島素分泌減少,β細胞質量和比例降低,胰島萎縮且結構紊亂;野生型小鼠STZ 40mg/kg連續(xù)3天造模血糖無明顯變化,而連續(xù)5天造模血糖迅速升高,β細胞胰島素分泌減少,胰島結構明顯破壞,β細胞比例下降且未發(fā)生代償性增殖;INS-1細胞沉默STAT3,與不同濃度STZ共孵育,STAT3敲低明顯促進細胞凋亡,抑制細胞增殖,STZ誘導的β-STAT3KO小鼠β細胞凋亡明顯增加,β細胞增殖與轉錄因子活性均受到抑制,而免疫細胞未參與該過程。第二部分STAT3通過PTEN-AKT調控β細胞凋亡的信號通路和分子機制研究方法:本研究分別采用大鼠胰島細胞瘤細胞株INS-1細胞、小鼠原代胰島細胞、人胚胎腎細胞293FT和STZ誘導的高血糖小鼠模型考察STAT3-PTEN信號通路調控β細胞凋亡的作用機制。(1)采用qRT-PCR法考察STZ誘導的野生型和β-STAT3KO小鼠原代胰島中糖代謝相關信號通路、胰島素信號通路和糖尿病相關基因變化;(2)通過ELISA和qRT-PCR方法檢測MyD88信號通路相關炎性因子變化;(3)通過siRNA技術干擾INS-1細胞STAT3表達,采用qRT-PCR和Western blotting檢測PTEN的表達情況;(4)通過Western blotting和Immunofluorescence檢測β-STAT3KO小鼠胰島中PTEN表達情況;(5)構建β細胞中STAT3-PTEN特異性敲除小鼠;(6)檢測STZ誘導后β-STAT3-PTENDKO、β-STAT3KO和野生型小鼠血糖及口服糖耐量變化;(7)通過 Immunofluorescence 法檢測 STZ 誘導后 β-STAT3KO、β-STAT3-PTENDKO和野生型小鼠胰島結構及細胞凋亡情況;(8)采用Luciferase法檢測PTEN調控β細胞相關轉錄因子轉錄活性;(9)通過qRT-PCR和Immunofluorescence考察β細胞相關轉錄因子基因和蛋白層面表達情況;(10)采用Western blotting和Immunohistochemistry法考察STAT3-PTEN下游蛋白變化情況;(11)通過AKT抑制劑考察STZ誘導后不同基因型小鼠血糖及口服糖耐量變化;(12)Western blotting和qRT-PCR檢測凋亡相關蛋白及β細胞相關轉錄因子表達情況。研究結果:(1)STAT3調控β細胞存活和功能的下游關鍵因子尋找小鼠胰島qRT-PCR結果顯示Myd88和Pten mRNA在β-STAT3KO小鼠胰島中表達明顯增加;β-STAT3KO小鼠胰島中MyD88相關促炎因子和趨化因子蛋白分泌和基因轉錄均無變化,并且在INS-1細胞中分別或共沉默STAT3、MyD88對細胞凋亡無影響;敲低STAT3,INS-細胞中PTEN的轉錄和翻譯水平均增加,并且在β-STAT3KO小鼠胰島中PTEN發(fā)生明顯累積,經(jīng)STZ誘導累積進一步加劇。(2)STAT3-PTEN特異性敲除對STZ誘導的高血糖小鼠的影響β-STAT3-PTENDKO小鼠成功構建;β細胞中STAT3-PTEN雙敲除逆轉STZ誘導的β-STAT3KO小鼠高血糖進程,并且改善口服糖耐受不良,保護胰島結構和功能,抑制β細胞凋亡。(3)STAT3-PTEN信號通路通過調控AKT影響β細胞存活和功能我們通過luciferase實驗發(fā)現(xiàn)沉默STAT3明顯抑制PDX1和MAFA基因轉錄活性,而進一步抑制PTEN能逆轉該現(xiàn)象;STAT3-PTEN特異性敲除有效逆轉高血糖β-STAT3KO小鼠相關轉錄因子活性,減少β細胞凋亡,增加PDX1+β細胞比例,并且促進PDX1、Nkx6.1和pAKT蛋白表達;AKT抑制劑AZD5363能阻斷STAT3-PTEN信號通路,誘導小鼠血糖升高,口服糖耐量發(fā)生變化,β細胞凋亡和相關轉錄因子抑制,其中對β-STAT3KO小鼠影響程度最大。第三部分PTEN抑制劑bpv(phen)對STAT3突變高血糖的治療作用研究方法:本研究分別采用STZ大劑量單次、STZ小劑量3次和5次的動物模型評價PTEN抑制劑bpv(phen)對高血糖的治療作用,并且使用AKT抑制劑AZD5363探索bpv(phen)參與調控β細胞功能的作用機制。(1)使用PTEN抑制劑bpv(phen)考察其對大劑量單次或小劑量5次STZ誘導的小鼠高血糖進程的影響;(2)使用PTEN抑制劑bpv(phen)考察對STZ誘導的β-STAT3KO小鼠體重及血糖的影響;(3)OGTT和ITT法考察bpv(phen)對STZ誘導的β-STAT3KO小鼠β細胞功能的影響;(4)采用Immunofluorescence和Immunohistochemistry法考察β細胞質量及胰島結構變化;(5)Western blotting和Immunostaining檢測bpv(phen)對β細胞存活和增殖相關基因的影響;(6)使用AKT抑制劑AZD5363考察對bpv(phen)作用下的STZ誘導的β-STAT3KO和野生型小鼠血糖和口服糖耐量影響;(7)通過Western blotting 比較 STZ誘導的β-STAT3-PTENDKO小鼠單用AZD5363和STZ誘導的β-STAT3KO小鼠合用bpv(phen)和AZD5363 兩者差異;(8)通過Immunofluorescence檢測bpv(phen)單用或與AZD5363合用下游信號通路變化。研究結果:(1)PTEN抑制劑對普通高血糖小鼠的治療作用實驗采用了 STZ 150 mg/kg大劑量單次和STZ 40 mg/kg小劑量連續(xù)5次兩種經(jīng)典的誘導高血糖的方法,分別對野生型小鼠進行誘導后連續(xù)給予bpv(phen)直到實驗終點,均無降低血糖作用。(2)PTEN抑制劑對STAT3特異性缺失小鼠高血糖的治療作用實驗采用了STZ 40 mg/kg小劑量連續(xù)3次對β-STAT3KO和同窩野生型小鼠進行誘導后給予bpv(phen),發(fā)現(xiàn)能有效逆轉β-STAT3KO小鼠高血糖并維持正常體重,同時改善β-STAT3KO小鼠口服糖耐受不良,促進STZ誘導的β-STAT3KO小鼠β細胞分泌足夠的胰島素調控血糖平衡,維持小鼠β細胞質量,保護小鼠胰島結構,抑制β細胞凋亡,促進β細胞增殖以及激活β細胞相關轉錄因子。(3)bpv(phen)調控AKT信號通路影響STZ誘導的β-STAT3KO小鼠高血糖進程我們將STZ小劑量連續(xù)3天造模后的野生型和β-STAT3KO小鼠各自分成兩組,進行bpv(phen)單用或與AZD5363合用,合用組β-STAT3KO小鼠血糖不斷上升,成功拮抗bpv(phen)單用的治療作用,并破壞了單用改善的β-STAT3KO小鼠口服糖耐量,合用組β-STAT3KO小鼠胰島萎縮且β細胞凋亡率明顯增加。研究結論:本研究在體內外模型中均證實STAT3在β細胞損傷后活性受到明顯抑制。構建β細胞中STAT3敲除小鼠((β-STAT3KO),發(fā)現(xiàn)其對小劑量多次STZ刺激更敏感,表現(xiàn)為血糖明顯升高,胰島β細胞凋亡。結果顯示,STAT3缺失條件下PTEN在β細胞中明顯累積,PTEN通過抑制AKT磷酸化,抑制β細胞相關轉錄因子活性,促進凋亡信號通路介導β細胞凋亡。進一步敲除β細胞中PTEN或使用PTEN抑制劑bpv(phen)能有效逆轉STZ誘導的β-STAT3KO小鼠高血糖進程,維持β細胞功能和存活。通過本課題的研究,不僅將揭示STAT3調控胰島β細胞影響高血糖進展的重要作用,還將揭示STAT3調控下PTEN介導的胰島β細胞凋亡全新分子機制,并挖掘PTEN作為特異性靶點,治療STAT3功能缺失性高血糖的作用,推動精準醫(yī)療發(fā)展。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R96

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本文編號：2814228