近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道:表觀遺傳酶組蛋白賴氨酸去甲基化酶1(LSD1)在胃癌、肺癌等腫瘤中高表達(dá)。靶向LSD1特異性抑制劑可抑制癌細(xì)胞增殖,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄抑制或者激活,并在DNA損傷修復(fù)中起重要作用。本研究旨在探索在胃癌細(xì)胞中靶向抑制LSD1的活性對(duì)DNA損傷類藥物阿霉素抗腫瘤的增敏作用及其分子機(jī)制。另一方面,PD-1是一個(gè)主要表達(dá)在活化T細(xì)胞上的抑制性受體,與其配體PD-L1結(jié)合可顯著抑制T細(xì)胞的活化和增殖,使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控和殺傷。在非小細(xì)胞肺癌(NSCLCS)中存在PD-L1和LSD1異常表達(dá),靶向PD-1和PD-L1的抗體類藥物也已經(jīng)證實(shí)起到良好的抗腫瘤效果。因此,本研究也同時(shí)探索在NSCLCS中PD-L1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是否受LSD1的表觀調(diào)控。本課題的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:第一部分:LSD1的活性抑制對(duì)DNA損傷類藥物阿霉素的抗腫瘤增敏作用及其分子機(jī)制1.MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示:LSD1的抑制劑GSK-LSD1 2HCL、C26和SP2509均可明顯抑制MGC-803細(xì)胞的增殖。提示LSD1的活性抑制可抑制胃癌細(xì)胞的增殖。2.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示:在MGC-803和SGC-7901細(xì)胞中LSD1的不可逆性抑制劑GSK-LSD1 2HCL和SP2509均不影響細(xì)胞的周期進(jìn)程,而本課題組設(shè)計(jì)的LSD1的不可逆抑制劑C26對(duì)細(xì)胞周期有一定的阻滯能力。進(jìn)一步在MGC-803細(xì)胞中用si RNA靶向降低LSD1的表達(dá),結(jié)果也不影響細(xì)胞的周期進(jìn)程,提示LSD1活性抑制不影響胃癌細(xì)胞的周期進(jìn)程。3.將LSD1的抑制劑2-PCPA與阿霉素(DOX)、5-Fu和順鉑等DNA損傷類藥物聯(lián)用的結(jié)果顯示:聯(lián)用組均比單用組能更明顯的抑制細(xì)胞的增殖,其中2-PCPA與低劑量的DOX聯(lián)用組的效果較好。4.LSD1的特異性抑制劑GSK-LSD1 2HCL與阿霉素(DOX)在細(xì)胞水平上的聯(lián)用結(jié)果顯示:在MGC-803和HGC-27細(xì)胞中,聯(lián)用組均能顯著上調(diào)促凋亡蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3和BAX的表達(dá),而下調(diào)抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)。進(jìn)一步在MGC-803細(xì)胞中用si RNA靶向降低LSD1的表達(dá)后與DOX聯(lián)用,結(jié)果仍顯示聯(lián)用組比單用組促凋亡蛋白Cleaved-PARP的表達(dá)增多,由此提示LSD1的活性抑制可能通過(guò)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路激活增敏DOX的促細(xì)胞凋亡的能力。5.LSD1的特異性抑制劑GSK-LSD1 2HCL與阿霉素(DOX)在整體動(dòng)物水平上的的聯(lián)用顯示:聯(lián)用組比單用組的瘤體積和瘤重量明顯減小,且Western blot顯示聯(lián)用組比單用組促凋亡蛋白Cleaved-PARP的表達(dá)增多,提示體內(nèi)LSD1的活性抑制也可以增強(qiáng)DOX的抗腫瘤活性。第二部分:LSD1對(duì)非小細(xì)胞肺癌中PD-L1的表達(dá)及其非免疫學(xué)功能的調(diào)節(jié)1.流式細(xì)胞術(shù)和Western blot的結(jié)果均可檢測(cè)到NSCLCS細(xì)胞系中PD-L1表達(dá),其中在H1975細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于其它細(xì)胞;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在H1975細(xì)胞中LSD1的表達(dá)也明顯高于其它細(xì)胞,結(jié)果提示在非小細(xì)胞肺癌中PD-L1的表達(dá)與LSD1的表達(dá)可能存在一定的相關(guān)性。2.抑制LSD1的活性可顯著降低H1975細(xì)胞中PD-L1的表達(dá),且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。用LSD1的si RNA靶向沉默LSD1后,PD-L1的蛋白表達(dá)量明顯降低。用IFNγ預(yù)先上調(diào)PD-L1的表達(dá)水平后,抑制LSD1的活性依然可劑量依賴性和時(shí)間依賴性降低PD-L1的蛋白表達(dá)。提示LSD1活性抑制可顯著下調(diào)PD-L1的蛋白表達(dá)水平,且不受腫瘤微環(huán)境的影響。3.無(wú)論是否存在IFNγ,抑制LSD1的活性均可顯著降低H1975細(xì)胞中PDL1的m RNA水平。結(jié)果還顯示無(wú)論是否存在IFNγ,LSD1的活性抑制均可顯著降低IFNGR1的蛋白表達(dá)和m RNA水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抑制LSD1的活性還可抑制干擾素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路的活化,降低p-JAK2和p-JAK3的蛋白表達(dá)。此外,還發(fā)現(xiàn)抑制LSD1的活性可以通過(guò)促進(jìn)P53的表達(dá),進(jìn)而抑制PD-L1的表達(dá)。4.慢病毒轉(zhuǎn)染沉默PD-L1的H1975細(xì)胞與對(duì)照組相比不易發(fā)生EMT過(guò)程,且細(xì)胞的增殖、遷移和劃痕修復(fù)能力降低。在H1975細(xì)胞中抑制LSD1的活性,細(xì)胞的EMT過(guò)程則不易發(fā)生,細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力降低。綜上所述,LSD1的活性抑制可抑制胃癌細(xì)胞的增殖并可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX的敏感性。LSD1可通過(guò)調(diào)節(jié)干擾素受體IFNGR1及干擾素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路和P53,調(diào)節(jié)H1975細(xì)胞中PD-L1的蛋白表達(dá)以及與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的PD-L1的非免疫學(xué)功能。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

將上述細(xì)胞裂解液放在 4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)中 12,000 r 高速離心 15 分的上清即為蛋白提取液。蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：16 μl 原濃度為 5 mg/ml 的 BCA標(biāo)準(zhǔn)蛋白+144 μl 的 PBS(配置的 BCA的)配制成終濃度為 0.5 mg/ml 的 BCA標(biāo)準(zhǔn)樣品。3.4 ml 的 BCA 中的 A 液+68 μl 的 BCA 中的 B 液(其中 A 液與 B 液的50:1)充分混勻后，放在冰上備用。96 孔板中加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的體積分別為 0、2、4、6、8、12、16、20應(yīng)各孔的 PBS 分別為：20、18、16、14、12、8、4、0 μl，每個(gè)濃副孔重復(fù)孔中加入提前配置好的 200 μl 的 BCA 溶液，然后將 96孔板放入 37 ℃育 20分鐘。酶標(biāo)儀的 562 nM 的波長(zhǎng)處測(cè)得蛋白質(zhì)的吸光度，并制備蛋白濃度標(biāo)圖：

圖 2.2 胃癌細(xì)胞株中 LSD1 存在異常表達(dá)A、B 圖：檢測(cè)胃黏膜上皮細(xì)胞株 GES-1 和不同分化程度的胃癌細(xì)胞株中 LSD1 的蛋白表達(dá)情況，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P< 0.05， **P<0.01，n=3，與 GES-1 細(xì)胞相比2.3.2 抑制 LSD1 的活性抑制胃癌細(xì)胞 MGC-803 的增殖我們進(jìn)一步選取 LSD1 表達(dá)水平較高的 MGC-803 胃癌細(xì)胞，檢測(cè) LSD1 抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。分別使用不同濃度梯度的 GSK-LSD1 2HCl、C26 和 SP2509 作用于 MGC-803 細(xì)胞 3 天和 6 天后，用 MTT 法檢測(cè) MGC-803細(xì)胞的存活率(如圖 2.3 中圖 A、B、C)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GSK-LSD1 作用 3 天和 6天的 IC50分別為 311.03 ± 36.14 μM 和 179.97 ± 16.03 μM，C26 作用 3 天和 6天的 IC50分別為 5.512 ± 0.69 μM 和 4.5225 ± 0.71 μM，SP2509作用 3天和 6天的IC50 分別為 4.282±1.534 μM 和 4.089±3.330 μM。同時(shí)我們也通過(guò)檢測(cè) LSD1 的底物 H3K4me2 水平，分析抑制劑對(duì) LSD1 活性的影響。分別使用不同濃度梯度的 GSK-LSD1 2HCl、C26、SP2509 作用于 MGC-803 細(xì)胞 4 天后，Western blot法檢測(cè) H3K4me2 (如圖 2.3 中圖 D-I)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種藥物都可以增加

圖 2.3 抑制 LSD1 的活性抑制胃癌細(xì)胞 MGC-803的增殖A 圖：給予 GSK-LSD1 2HCl（0，15.6，62.5，250，1000 μM）作用 3 天和 6 天后檢測(cè)細(xì)胞增殖；B 圖中給予 C26（0，0.16，0.63，2.5，10 μM）作用 3天和 6 天后檢測(cè)細(xì)胞增殖；C圖：給予 SP2509(0，0.31，1.25，5，20 μM) 作用 3 天和 6 天后后檢測(cè)細(xì)胞增殖 ；D、E 圖：給予 GSK-LSD1 2HCl（0，1，10，100 μM）作用 4 天后檢測(cè) H3K4me2 的表達(dá)；F、G 圖：給予 C26（0，0.1，0.3，1，3 μM）作用 4 天后檢測(cè) H3K4me2 的表達(dá)；H、I圖：給予SP2509(0，0.01，0.1，1，10 μM) 作用 4 天后檢測(cè) H3K4me2 的表達(dá)，*P< 0.05，**P<0.01,n=3，與未加藥組相比。2.3.3 抑制 LSD1 的活性不影響胃癌細(xì)胞的周期進(jìn)展有文獻(xiàn)報(bào)道 LSD1 參與調(diào)控 DNA損傷修復(fù)過(guò)程。為此，我們使用流式細(xì)胞術(shù)分析了 LSD1 抑制劑是否會(huì)引起細(xì)胞周期阻滯。使用不同濃度梯度的 GSK-LSD1 2HCL 和 SP2509 處理 MGC-803 細(xì)胞 4 天，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)展情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) GSK-LSD1 2HCL 和 SP2509 均不影響細(xì)胞周期分布(圖 2.3中圖 A、B) 。當(dāng)使用 100 μM 的 GSK-LSD1 2HCL處理 SGC-7901 和 MGC-803 細(xì)胞 1- 6天時(shí)，依然不會(huì)引起細(xì)胞周期阻滯(圖 2.3中 圖 C、D)。在 SGC-7901細(xì)胞中，使用 0.3 μM的 C26處理 1-3天，發(fā)現(xiàn) C26

【參考文獻(xiàn)】

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1 張亞;彭成浩;;免疫共刺激分子PD-1與PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J];醫(yī)學(xué)綜述;2015年24期

2 王婕;劉聲茂;王樹(shù)龍;袁琦;賈冶;;組蛋白修飾與相關(guān)疾病研究[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2015年03期

3 姜鵬;劉凱;王若崢;;T細(xì)胞免疫與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年01期

4 崔宏偉;蘇秀蘭;;表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2014年19期

5 陳曉娟;閆少春;邵國(guó);;人DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的分類及其功能[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2014年04期

6 鄭一超;馬金蓮;王志茹;李金鳳;趙文;劉宏民;;抗腫瘤藥物新靶點(diǎn):表觀遺傳組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2014年01期

7 吳瓊;邵國(guó);張培禮;;DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶與乳腺癌相關(guān)性的研究進(jìn)展[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年06期

8 金鐵峰;張美花;林貞花;;腫瘤表觀遺傳學(xué)[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2011年02期

9 方向陽(yáng);羅宏;朱向光;;大劑量吡喃阿霉素治療惡性腫瘤的臨床觀察[J];中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù);2007年02期

10 鄭聯(lián)合,張偉,韓濤,馬保安,范清宇;阿霉素可通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)成骨肉瘤細(xì)胞凋亡[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年12期

本文編號(hào)：2807467