【摘要】：目的1.探討木犀草素與紫杉醇在體外聯(lián)用對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響及作用機(jī)制。2.探討木犀草素與紫杉醇在體內(nèi)聯(lián)用對(duì)食管癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、凋亡的影響及分子機(jī)制,并對(duì)此給藥方案的潛在毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。方法1.采用SRB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)于食管癌細(xì)胞活力的影響。使用細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成的影響。2.采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)于食管癌細(xì)胞遷移的影響;使用倒置顯微鏡觀察木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)食管癌細(xì)胞形態(tài)的影響;采用Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)SIRT1及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。3.使用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)于食管癌細(xì)胞凋亡的影響,使用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)于食管癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響,采用Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)線粒體凋亡通路、ROS/JNK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。4.建立食管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)于食管癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。通過(guò)HE染色及TUNEL染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)于食管癌細(xì)胞體內(nèi)凋亡的影響。通過(guò)HE染色實(shí)驗(yàn)及裸鼠體重監(jiān)測(cè)對(duì)兩種藥物聯(lián)用的潛在毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。通過(guò)Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)裸鼠移植瘤組織中SIRT1、EMT相關(guān)蛋白、線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白、ROS/JNK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況,探討木犀草素與紫杉醇聯(lián)用的體內(nèi)機(jī)制。結(jié)果1.木犀草素與紫杉醇聯(lián)用協(xié)同抑制食管癌細(xì)胞活力;木犀草素與紫杉醇聯(lián)用協(xié)同抑制食管癌細(xì)胞增殖及克隆形成。2.木犀草素和紫杉醇聯(lián)用協(xié)同抑制食管癌細(xì)胞遷移并改變食管癌細(xì)胞形態(tài);木犀草素和紫杉醇聯(lián)用協(xié)同抑制SIRT1蛋白的表達(dá),抑制間質(zhì)標(biāo)志蛋白NCadherin、β-Catenin、Vimentin的表達(dá),促進(jìn)上皮標(biāo)志蛋白E-Cadherin、Claudin-1、ZO-1的表達(dá)。3.木犀草素與紫杉醇聯(lián)用可協(xié)同促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡,協(xié)同抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表達(dá),促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá),促進(jìn)BH3-only死亡因子Noxa的表達(dá),促進(jìn)Cleaved Caspase-9蛋白和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)。木犀草素與紫杉醇聯(lián)用可協(xié)同提高食管癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,協(xié)同上調(diào)p-ASK1、p-MKK4、JNK及p-JNK蛋白的表達(dá)。4.在食管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型上,木犀草素與紫杉醇聯(lián)用可以協(xié)同抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)食管癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的體內(nèi)凋亡;木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)食管癌裸鼠移植瘤中SIRT1、EMT相關(guān)蛋白、線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白、ROS/JNK通路相關(guān)蛋白的影響與體外結(jié)果基本一致。木犀草素與紫杉醇聯(lián)用對(duì)裸鼠體重沒(méi)有明顯影響,對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟沒(méi)有明顯的毒性。結(jié)論1.木犀草素與紫杉醇在體外聯(lián)用時(shí)可協(xié)同調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡;其抑制細(xì)胞遷移的分子機(jī)制與抑制SIRT1及細(xì)胞EMT進(jìn)程相關(guān),其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制與ROS/JNK通路和線粒體凋亡通路的激活相關(guān)。2.木犀草素與紫杉醇在體內(nèi)聯(lián)用時(shí)可協(xié)同抑制食管癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)凋亡。在治療劑量下,兩種藥物聯(lián)用無(wú)明顯毒性。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【圖文】：

工作液的配制：根據(jù)樣品數(shù)量，按 BCA 試劑 A 液:BCA 試劑 工作液，充分混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。定量標(biāo)曲制作：根據(jù)表 2.3 中的數(shù)據(jù)將 PBS(蛋白定量專(zhuān)用)、A 工作液加入 96 孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。表 2.3 BCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線μg/μL） 0.0 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14 μL） 20.0 19.0 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 7.0 液（μL） 0.0 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0（μL） 200 200 200 200 200 200 200 200 200后將 96 孔板在 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育 20min。用酶標(biāo)儀測(cè) OD 值，取蛋白濃度和 OD 值曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出蛋白濃 2.1。

從定影液中取出膠片，用自來(lái)水將膠片沖洗干凈后，晾干。用儀掃描膠片，用光影魔術(shù)手截取條帶，用 Image J 對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析2.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。實(shí)驗(yàn)使用 GraphPadPrism 軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較采用 Bonferro法，P<0.05 表明數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 木犀草素單用抑制食管癌細(xì)胞活力首先，檢測(cè)不同濃度的木犀草素對(duì)于食管癌 EC109 及 TE-1 細(xì)胞的細(xì)胞的影響。如圖 2.2 所示，在 EC109 及 TE-1 細(xì)胞中，隨著加藥濃度及藥物作間的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，提示木犀草素以時(shí)間和劑量依賴(lài)方式抑制食細(xì)胞 EC109 及 TE-1 的細(xì)胞活力。

第二章 木犀草素與紫杉醇聯(lián)用體外抗食管癌效果及機(jī)制研究2.3.2 木犀草素單用抑制食管癌細(xì)胞遷移腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥惡化的一個(gè)危險(xiǎn)指征。因此我們選用遷移能力強(qiáng)的管癌細(xì)胞 TE-1 來(lái)檢測(cè)木犀草素對(duì)于細(xì)胞遷移的影響。采用劃痕實(shí)驗(yàn)法，實(shí)驗(yàn)果如圖 2.3 所示，與 NC 組相比，10 μM，20 μM 濃度的木犀草素能顯著抑制管癌細(xì)胞 TE-1 的遷移（P<0.01）。其中，20μM 的木犀草素抑制細(xì)胞遷移能力強(qiáng)。

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本文編號(hào)：2806606