發(fā)布時間：2020-08-27 16:59

【摘要】：血栓性疾病是由血栓形成和栓塞兩種病理性變化所引起的疾病,近年來,血栓性疾病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增加,而且致殘率和致死率均較高,嚴重危害著人類的生命健康。在過去十幾年中,溶栓藥物已經(jīng)廣泛應用于血栓性疾病的治療中,基于這些藥物的溶栓機制,可以將其分為兩種類型:一種是纖溶酶原激活劑,另一種是纖溶酶樣的蛋白。但是,盡管這些溶栓藥物在血栓的預防和治療過程中發(fā)揮了一定作用、而且應用廣泛,卻存在不容忽視的缺點:如過度纖溶引發(fā)機體出血、對纖維蛋白的底物特異性較低、以及價格昂貴等。因此,尋找更安全有效且價格低廉的溶栓藥物仍然是一個迫切需要解決的問題。在過去十幾年的研究中,微生物來源的新型溶栓劑展現(xiàn)出良好的特性,逐漸引起研究人員的濃厚興趣。如納豆激酶。近年來也有過自真菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)具較高纖溶活性蛋白的報道,如黃曲霉(Aspergillus ochraceus),尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等。內(nèi)生真菌是一個比較特殊而且很重要的群體,目前在內(nèi)生真菌與溶栓藥物方面的研究報道較少。本實驗研究自植物內(nèi)生真菌中篩選獲得一株高產(chǎn)纖溶酶菌株,分離、純化目的酶,并對其酶學特性進行研究。為尋找新型纖溶酶用于溶栓藥物的開發(fā)提供了新的資源。自采集的植物標本中共分離純化獲得486株植物內(nèi)生菌,以脫脂奶粉平板為初篩模型,首先篩選獲得產(chǎn)蛋白酶的菌株;以纖維蛋白平板為復篩模型,進一步篩選獲得產(chǎn)纖溶酶的菌株,最終自486株植物內(nèi)生菌中篩選獲得一株高產(chǎn)纖溶酶的菌株,通過形態(tài)學和分子生物學鑒定方法的結(jié)合,鑒定產(chǎn)酶菌株為露濕漆斑菌(Myrothecium roridum)。將多種蛋白純化的方法相結(jié)合,自菌株發(fā)酵粗提取液中分離純化目的酶,最終確定純化流程為:發(fā)酵粗提液→硫酸銨沉淀→透析→陰離子交換層析→陽離子交換層析→Native-PAGE。對其中每個純化步驟的條件進行優(yōu)化。最終確定純化條件為:硫酸銨沉淀最優(yōu)區(qū)間為50%~70%;透析脫鹽緩沖液為0.1M、pH(7.2~7.4)的Tris-HCl;陰離子交換層析:填料為DEAE-Sepharose FF、緩沖體系的pH為6.5;陽離子交換層析:填料為Sepharose-6FF,緩沖體系pH為4.5;通過Native-PAGE電泳進一步提高目的酶的純度,切膠回收進行蛋白質(zhì)譜鑒定,結(jié)果分析該酶屬于肽酶M36家族。對目的酶的酶學特性進行研究。通過SDS-PAGE蛋白電泳初步估算出目的酶的分子量約為30kDa;通過纖維蛋白平板檢測活性,檢測了溫度、pH、金屬離子、蛋白酶抑制劑等對酶的活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的酶的最適作用溫度在40℃左右,而且在37℃下孵育4h以上仍能保持較高的酶活,推測該酶可以適應人體的溫度環(huán)境;酶在pH3~11之間均能保持一定的活性,具有廣泛的pH適應性;金屬離子對酶的活性影響不明顯,推測該酶能夠適應人體比較復雜的離子環(huán)境;通過纖維蛋白平板檢測活性和SDS-PAGE蛋白電泳,對酶的激酶活性和底物專一性進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶可以直接水解纖維蛋白發(fā)揮溶栓作用;酶對纖維蛋白原具有水解作用,具有預防血栓形成的潛能。通過體外模擬胃液環(huán)境,進一步確定該纖溶酶在較低pH(3~5)的環(huán)境下仍能保持一定活性;采集大鼠靜脈血制作血凝塊,體外模擬溶栓實驗,進一步驗證該纖溶酶確實具有溶解血栓的能力;同時實驗觀察了酶對血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)形態(tài)的影響,結(jié)果在實驗劑量的纖溶酶的作用下,HUVEC的細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。以上實驗為接下來對該纖溶酶進一步的藥效學研究提供了數(shù)據(jù)參考。綜上,本實驗研究自植物內(nèi)生真菌中篩選獲得一株高產(chǎn)纖溶酶菌株,菌株鑒定為露濕漆斑菌(Myrothecium roridum);優(yōu)化出分離純化該纖溶酶的合適條件;對其酶學特性進行研究,發(fā)現(xiàn)該酶能夠適應人體的溫度環(huán)境(37℃耐受)和復雜的離子環(huán)境;該纖溶酶的分子量較小,容易被吸收;可以通過直接降解纖維蛋白發(fā)揮溶栓作用、具水解纖維蛋白原的活性,推測該酶兼有預防和治療血栓的潛能;同時該酶具有較廣泛的pH適應性(pH3~11),推測該酶兼有開發(fā)成為口服和靜脈注射用藥的潛能;另外,本實驗中體外模擬血栓溶解實驗、細胞毒性實驗為對該纖溶酶進一步的藥理、藥效學研究提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R915
【圖文】：

第一章 緒 論 凝血系統(tǒng)血液凝固是一系列比較復雜的化學連鎖反應過程，最終血液由流動的狀態(tài)變不流動的凝塊，參與各個連鎖反應的物質(zhì)組成了凝血系統(tǒng)，這些物質(zhì)即為凝子[10,13]。血液凝固過程中，一系列的凝血因子相繼被激活。凝固的過程大致可以分為階段[10]（圖 1.1）。第一階段形成凝血酶原激活物。第二階段形成凝血酶，凝原激活物在 Ca2+的參與下，催化凝血酶原轉(zhuǎn)換為有活性的凝血酶。第三階段纖維蛋白，即血栓的基質(zhì)。凝血酶作用于纖維蛋白原，生成纖維蛋白單體相互結(jié)合，在凝血因子 XIIIa 的作用下形成纖維蛋白多聚體，即纖維蛋白

第一章 緒 論.2.2 纖溶系統(tǒng)血栓形成是當血液中的凝血機制被過度地激活，血小板以及被激活的凝血相互作用，從而形成了具有一定結(jié)構(gòu)且較穩(wěn)定的凝血塊，在機體纖溶系統(tǒng)的下，這些凝血塊能夠被緩慢地降解[12]。哺乳動物可以通過纖溶系統(tǒng)來維持血凝血與溶解的平衡，探究纖溶系統(tǒng)的溶栓機制對溶栓藥物的研發(fā)具有重要的[12,13]（圖 1.2）。纖溶酶原激活劑（Plasminogen activator，PA）激活纖溶酶原（Plasminognelg)，使之變?yōu)橛谢钚缘睦w溶酶((Plasmin，Pl)，凝血塊中的主要基質(zhì)為纖維蛋Fibrin，F(xiàn)），纖溶酶可以直接將纖維蛋白溶解，使之不能在血管中長期存在防止血栓的形成[14]�，F(xiàn)行的大部分溶栓藥物都是纖溶酶原激活劑類似物，通活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶，對血栓進行溶解。

技術(shù)路線圖

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本文編號：2806372