【摘要】：血栓性疾病是由血栓形成和栓塞兩種病理性變化所引起的疾病,近年來(lái),血栓性疾病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增加,而且致殘率和致死率均較高,嚴(yán)重危害著人類(lèi)的生命健康。在過(guò)去十幾年中,溶栓藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血栓性疾病的治療中,基于這些藥物的溶栓機(jī)制,可以將其分為兩種類(lèi)型:一種是纖溶酶原激活劑,另一種是纖溶酶樣的蛋白。但是,盡管這些溶栓藥物在血栓的預(yù)防和治療過(guò)程中發(fā)揮了一定作用、而且應(yīng)用廣泛,卻存在不容忽視的缺點(diǎn):如過(guò)度纖溶引發(fā)機(jī)體出血、對(duì)纖維蛋白的底物特異性較低、以及價(jià)格昂貴等。因此,尋找更安全有效且價(jià)格低廉的溶栓藥物仍然是一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。在過(guò)去十幾年的研究中,微生物來(lái)源的新型溶栓劑展現(xiàn)出良好的特性,逐漸引起研究人員的濃厚興趣。如納豆激酶。近年來(lái)也有過(guò)自真菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)具較高纖溶活性蛋白的報(bào)道,如黃曲霉(Aspergillus ochraceus),尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等。內(nèi)生真菌是一個(gè)比較特殊而且很重要的群體,目前在內(nèi)生真菌與溶栓藥物方面的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)研究自植物內(nèi)生真菌中篩選獲得一株高產(chǎn)纖溶酶菌株,分離、純化目的酶,并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行研究。為尋找新型纖溶酶用于溶栓藥物的開(kāi)發(fā)提供了新的資源。自采集的植物標(biāo)本中共分離純化獲得486株植物內(nèi)生菌,以脫脂奶粉平板為初篩模型,首先篩選獲得產(chǎn)蛋白酶的菌株;以纖維蛋白平板為復(fù)篩模型,進(jìn)一步篩選獲得產(chǎn)纖溶酶的菌株,最終自486株植物內(nèi)生菌中篩選獲得一株高產(chǎn)纖溶酶的菌株,通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法的結(jié)合,鑒定產(chǎn)酶菌株為露濕漆斑菌(Myrothecium roridum)。將多種蛋白純化的方法相結(jié)合,自菌株發(fā)酵粗提取液中分離純化目的酶,最終確定純化流程為:發(fā)酵粗提液→硫酸銨沉淀→透析→陰離子交換層析→陽(yáng)離子交換層析→Native-PAGE。對(duì)其中每個(gè)純化步驟的條件進(jìn)行優(yōu)化。最終確定純化條件為:硫酸銨沉淀最優(yōu)區(qū)間為50%~70%;透析脫鹽緩沖液為0.1M、pH(7.2~7.4)的Tris-HCl;陰離子交換層析:填料為DEAE-Sepharose FF、緩沖體系的pH為6.5;陽(yáng)離子交換層析:填料為Sepharose-6FF,緩沖體系pH為4.5;通過(guò)Native-PAGE電泳進(jìn)一步提高目的酶的純度,切膠回收進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定,結(jié)果分析該酶屬于肽酶M36家族。對(duì)目的酶的酶學(xué)特性進(jìn)行研究。通過(guò)SDS-PAGE蛋白電泳初步估算出目的酶的分子量約為30kDa;通過(guò)纖維蛋白平板檢測(cè)活性,檢測(cè)了溫度、pH、金屬離子、蛋白酶抑制劑等對(duì)酶的活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的酶的最適作用溫度在40℃左右,而且在37℃下孵育4h以上仍能保持較高的酶活,推測(cè)該酶可以適應(yīng)人體的溫度環(huán)境;酶在pH3~11之間均能保持一定的活性,具有廣泛的pH適應(yīng)性;金屬離子對(duì)酶的活性影響不明顯,推測(cè)該酶能夠適應(yīng)人體比較復(fù)雜的離子環(huán)境;通過(guò)纖維蛋白平板檢測(cè)活性和SDS-PAGE蛋白電泳,對(duì)酶的激酶活性和底物專(zhuān)一性進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶可以直接水解纖維蛋白發(fā)揮溶栓作用;酶對(duì)纖維蛋白原具有水解作用,具有預(yù)防血栓形成的潛能。通過(guò)體外模擬胃液環(huán)境,進(jìn)一步確定該纖溶酶在較低pH(3~5)的環(huán)境下仍能保持一定活性;采集大鼠靜脈血制作血凝塊,體外模擬溶栓實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證該纖溶酶確實(shí)具有溶解血栓的能力;同時(shí)實(shí)驗(yàn)觀察了酶對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)形態(tài)的影響,結(jié)果在實(shí)驗(yàn)劑量的纖溶酶的作用下,HUVEC的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。以上實(shí)驗(yàn)為接下來(lái)對(duì)該纖溶酶進(jìn)一步的藥效學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)參考。綜上,本實(shí)驗(yàn)研究自植物內(nèi)生真菌中篩選獲得一株高產(chǎn)纖溶酶菌株,菌株鑒定為露濕漆斑菌(Myrothecium roridum);優(yōu)化出分離純化該纖溶酶的合適條件;對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)該酶能夠適應(yīng)人體的溫度環(huán)境(37℃耐受)和復(fù)雜的離子環(huán)境;該纖溶酶的分子量較小,容易被吸收;可以通過(guò)直接降解纖維蛋白發(fā)揮溶栓作用、具水解纖維蛋白原的活性,推測(cè)該酶兼有預(yù)防和治療血栓的潛能;同時(shí)該酶具有較廣泛的pH適應(yīng)性(pH3~11),推測(cè)該酶兼有開(kāi)發(fā)成為口服和靜脈注射用藥的潛能;另外,本實(shí)驗(yàn)中體外模擬血栓溶解實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)為對(duì)該纖溶酶進(jìn)一步的藥理、藥效學(xué)研究提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R915
【圖文】：

第一章 緒 論 凝血系統(tǒng)血液凝固是一系列比較復(fù)雜的化學(xué)連鎖反應(yīng)過(guò)程，最終血液由流動(dòng)的狀態(tài)變不流動(dòng)的凝塊，參與各個(gè)連鎖反應(yīng)的物質(zhì)組成了凝血系統(tǒng)，這些物質(zhì)即為凝子[10,13]。血液凝固過(guò)程中，一系列的凝血因子相繼被激活。凝固的過(guò)程大致可以分為階段[10]（圖 1.1）。第一階段形成凝血酶原激活物。第二階段形成凝血酶，凝原激活物在 Ca2+的參與下，催化凝血酶原轉(zhuǎn)換為有活性的凝血酶。第三階段纖維蛋白，即血栓的基質(zhì)。凝血酶作用于纖維蛋白原，生成纖維蛋白單體相互結(jié)合，在凝血因子 XIIIa 的作用下形成纖維蛋白多聚體，即纖維蛋白

第一章 緒 論.2.2 纖溶系統(tǒng)血栓形成是當(dāng)血液中的凝血機(jī)制被過(guò)度地激活，血小板以及被激活的凝血相互作用，從而形成了具有一定結(jié)構(gòu)且較穩(wěn)定的凝血塊，在機(jī)體纖溶系統(tǒng)的下，這些凝血塊能夠被緩慢地降解[12]。哺乳動(dòng)物可以通過(guò)纖溶系統(tǒng)來(lái)維持血凝血與溶解的平衡，探究纖溶系統(tǒng)的溶栓機(jī)制對(duì)溶栓藥物的研發(fā)具有重要的[12,13]（圖 1.2）。纖溶酶原激活劑（Plasminogen activator，PA）激活纖溶酶原（Plasminognelg)，使之變?yōu)橛谢钚缘睦w溶酶((Plasmin，Pl)，凝血塊中的主要基質(zhì)為纖維蛋Fibrin，F(xiàn)），纖溶酶可以直接將纖維蛋白溶解，使之不能在血管中長(zhǎng)期存在防止血栓的形成[14]。現(xiàn)行的大部分溶栓藥物都是纖溶酶原激活劑類(lèi)似物，通活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶，對(duì)血栓進(jìn)行溶解。

技術(shù)路線圖

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王聰艷;周志國(guó);武漢琴;;植物內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J];生物學(xué)教學(xué);2015年03期

2 李明;植物內(nèi)生真菌[J];生物學(xué)教學(xué);2003年05期

3 ;《菌物學(xué)報(bào)》“藥用植物內(nèi)生真菌專(zhuān)刊”征稿通知[J];菌物學(xué)報(bào);2017年03期

4 趙歡;;藥用植物內(nèi)生真菌的研究進(jìn)展[J];北方園藝;2017年13期

5 趙麗萍;張紐枝;;淺析植物內(nèi)生真菌的篩選與種類(lèi)[J];新疆農(nóng)墾科技;2014年12期

6 馬福歡;;植物內(nèi)生真菌的研究概論[J];廣西農(nóng)學(xué)報(bào);2013年02期

7 張黎光;魏希穎;馬彩霞;;藥用植物內(nèi)生真菌—生物活性物質(zhì)的新來(lái)源[J];藥物生物技術(shù);2011年05期

8 孫奎;;藥用植物內(nèi)生真菌的研究進(jìn)展[J];青海農(nóng)林科技;2010年01期

9 徐范范;金波;丁志山;;藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2010年17期

10 曾培源;吳錦忠;;國(guó)外植物內(nèi)生真菌活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J];海峽藥學(xué);2010年11期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 蘇磊;鄧暉;牛永春;;利用培養(yǎng)和非培養(yǎng)方法研究瓜類(lèi)植物內(nèi)生真菌多樣性[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2016年

2 賀丹;王麗;李涵;錢(qián)永清;李廣泉;高磊;橫山耕治;;植物內(nèi)生真菌的多樣性及其代謝產(chǎn)物活性研究[A];2010年中國(guó)菌物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2010年

3 郭順星;陳曉梅;;藥用植物內(nèi)生真菌研究及應(yīng)用[A];第四屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì)論文集[C];2012年

4 張?jiān)葡?習(xí)平根;吳瑕;向梅梅;姜子德;;廣藿香和穿心蓮內(nèi)生真菌的鑒定[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2009年

5 胡殿明;管觀秀;詹香香;;江西淡水植物內(nèi)生真菌資源調(diào)查[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)第六屆會(huì)員代表大會(huì)（2014年學(xué)術(shù)年會(huì)）暨貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇會(huì)議摘要[C];2014年

6 陳鳳美;孫勇;蔣繼宏;毛銀蘭;;植物內(nèi)生真菌抑制細(xì)菌活性菌株的篩選[A];第三屆全國(guó)綠色環(huán)保肥料新技術(shù)、新產(chǎn)品交流會(huì)論文集[C];2003年

7 李治瀅;陳有為;楊麗源;李紹蘭;吳少華;;1株附子植物內(nèi)生真菌的抗菌活性[A];2008年中國(guó)微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

8 孟益明;張琪;劉永俊;馮虎元;;長(zhǎng)期施肥高寒草甸三種植物內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)2015年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2015年

9 李紹蘭;李文龍;楊麗源;李治瀅;吳少華;陳有為;;丁茄植物內(nèi)生真菌的研究[A];2008年中國(guó)微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

10 孫翔;郭良棟;;我國(guó)沿海主要鹽生植物內(nèi)生真菌群落及其多樣性[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)第七屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨2017年學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集[C];2017年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 蘇磊;瓜類(lèi)植物內(nèi)生真菌的分類(lèi)學(xué)和多樣性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

2 王麗薇;六種藥用植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物及其生物活性研究[D];浙江大學(xué);2011年

3 林挺;四株植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究[D];廈門(mén)大學(xué);2009年

4 王建鋒;植物內(nèi)生真菌抗腫瘤活性物質(zhì)的研究[D];廈門(mén)大學(xué);2001年

5 張弘弛;兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究[D];陜西科技大學(xué);2012年

6 胡克興;石斛屬藥用植物內(nèi)生真菌多樣性研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

7 杜永吉;野生羊茅屬植物內(nèi)生真菌及其共生體抗逆性研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2010年

8 胡德軍;三株植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究[D];上海交通大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐燕;植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物乙酰膽堿酯酶和單胺氧化酶的抑制活性研究[D];吉林大學(xué);2019年

2 韓慧玲;植物內(nèi)生真菌來(lái)源纖溶酶的篩選及其酶學(xué)特性的探究[D];吉林大學(xué);2019年

3 黃桂紅;植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究及化學(xué)表觀遺傳學(xué)的應(yīng)用初探[D];廈門(mén)大學(xué);2017年

4 周雯娜;云南大圍山苔蘚、蕨類(lèi)和種子植物內(nèi)生真菌多樣性研究[D];昆明理工大學(xué);2015年

5 周玲;植物內(nèi)生真菌米曲霉的次生代謝產(chǎn)物研究[D];云南民族大學(xué);2018年

6 李露瑩;6株荒漠植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

7 孫建慧;五種植物內(nèi)生真菌的分離純化及生物活性研究[D];蘭州理工大學(xué);2018年

8 趙冬梅;植物內(nèi)生真菌來(lái)源的單胺氧化酶抑制劑的篩選和純化[D];吉林大學(xué);2017年

9 張鵬亮;兩株植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物及其生物活性研究[D];山東大學(xué);2017年

10 張冰洋;兩株植物內(nèi)生真菌Talaromyces purpureogenus和Penicillium rapier中次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究[D];河北大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2806372