【摘要】：腫瘤的治療是當(dāng)今社會(huì)面臨的重大課題�；熢谀[瘤的治療中占主導(dǎo)地位,但是化療藥物一方面存在溶解性差、生物利用度低及副作用大的缺點(diǎn);另一方面,由于腫瘤細(xì)胞多藥耐藥現(xiàn)象的存在,最終導(dǎo)致化療失敗。腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)(targeted drug delivery system,TDDS),能夠顯著提高藥物溶解度及生物利用度,通過(guò)EPR效應(yīng)增強(qiáng)在腫瘤組織的分布,并進(jìn)一步通過(guò)修飾配體的作用,與腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)的受體特異性結(jié)合,增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,增強(qiáng)療效,降低毒副作用。但是,目前TDDS仍然存在腫瘤靶向性不高,療效提高有限等缺陷。與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞代謝活性顯著增強(qiáng),其增強(qiáng)的糖酵解速率需要攝取大量的葡萄糖來(lái)進(jìn)行補(bǔ)償,因而,腫瘤細(xì)胞表面存在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT)的過(guò)表達(dá)。與受體介導(dǎo)的細(xì)胞攝取相比,轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的細(xì)胞攝取有更快的轉(zhuǎn)運(yùn)速率以及更高的特異性,因此,葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)體是很有潛力的用于腫瘤細(xì)胞靶向遞藥的靶點(diǎn),然而,目前基于GLUT為靶點(diǎn)的TDDS研究還不多。腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的胞內(nèi)外微環(huán)境與正常細(xì)胞也有顯著差別,腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)濃度比正常細(xì)胞高4倍以上,比胞外GSH濃度高5000倍以上,這種GSH分布的巨大差別可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)TDDS在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的可控化釋藥,實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)藥物濃度的最大化,增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞作用,并降低對(duì)正常組織毒性。以往的研究通過(guò)GSH敏感鍵交聯(lián)聚合物制備TDDS,雖然能夠?qū)崿F(xiàn)GSH敏感釋藥的目的,但是往往需要復(fù)雜的設(shè)計(jì)及制備過(guò)程,從為數(shù)不多TDDS的成功案例分析,除了安全性和有效性外,靶向制劑制備過(guò)程的簡(jiǎn)便化和經(jīng)濟(jì)化也是其能否成功向臨床進(jìn)行轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。基于此,本研究首先設(shè)計(jì)了一種安全有效且制備簡(jiǎn)便的GLUT1靶向及GSH還原敏感釋藥的高分子-藥物偶聯(lián)物TDDS,該系統(tǒng)以聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物(PAMAM)為載體,以GLUT1底物D-葡萄糖(D-glucose)為特異性靶向配體,通過(guò)聚乙二醇(PEG)與PAMAM進(jìn)行偶聯(lián),喜樹(shù)堿(CPT)為模型藥,通過(guò)GSH敏感的二硫鍵連接在PAMAM上,最終合成了 Glucose-PEG-PAMAM-s-s-CPT(GPCC)偶聯(lián)物。其粒徑為20nm,在體外高濃度GSH環(huán)境中釋藥遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于正常生理環(huán)境,具有GSH還原敏感性;在2D腫瘤細(xì)胞及3D腫瘤球模型中,與對(duì)照組相比,GLUT1高表達(dá)的HepG2細(xì)胞對(duì)GPCC偶聯(lián)物的攝取增強(qiáng),而GLUT1低表達(dá)的L02細(xì)胞則沒(méi)有顯著性差異(p0.05);GPCC偶聯(lián)物與未修飾D-葡萄糖的偶聯(lián)物相比,細(xì)胞毒性更強(qiáng),細(xì)胞周期分析顯示GPCC偶聯(lián)物具有更高的S期阻滯率,細(xì)胞凋亡分析顯示GPCC偶聯(lián)物對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率更高;藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明GPCC具有更大的最大血藥濃度(Cmax)、更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間(t1/2增加),且生物利用度增加(AUC增加);在荷H22肝瘤小鼠模型上,體內(nèi)外活體成像表明,GPCC偶聯(lián)物在腫瘤部位聚集增加,具有明顯的腫瘤靶向性;藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明GPCC能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng),具有更好的藥效,但是體重減少最小,結(jié)合HE染色證明其對(duì)肝腎正常組織的毒性較小。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的另外一個(gè)重要原因,腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象的原因與外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體p-gp的表達(dá)增多密切相關(guān),目前針對(duì)p-gp進(jìn)行克服腫瘤MDR研究的策略主要有:藥物包裹于TDDS中避免被p-gp外排;藥物共遞送系統(tǒng),如小分子抗腫瘤藥/大分子基因、化療敏感劑/小分子抗腫瘤藥、抗腫瘤藥/細(xì)胞耐藥抑制劑等;線(xiàn)粒體靶向促進(jìn)細(xì)胞凋亡,如線(xiàn)粒體靶向給藥抑制線(xiàn)粒體活性氧的產(chǎn)生、增加線(xiàn)粒體膜通透性、靶向Bcl-2蛋白抑制或下調(diào)細(xì)胞抗凋亡作用、靶向遞送治療基因增加促凋亡蛋白Bax和Bak的表達(dá)等。p-gp作為ATP依賴(lài)型轉(zhuǎn)運(yùn)體,在轉(zhuǎn)運(yùn)底物時(shí)需要消耗ATP,而線(xiàn)粒體是細(xì)胞的“能量工廠(chǎng)”,通過(guò)線(xiàn)粒體靶向,破壞線(xiàn)粒體功能,可切斷p-gp的ATP供應(yīng),使p-gp活性降低,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥現(xiàn)象,目前通過(guò)切斷p-gp能量供應(yīng)克服多藥耐藥的研究還不多。此外,由于線(xiàn)粒體靶向通常對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞沒(méi)有選擇性,容易導(dǎo)致嚴(yán)重副作用,因而首先實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞靶向,進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)線(xiàn)粒體靶向是較優(yōu)的選擇,腫瘤組織獨(dú)特的微環(huán)境為實(shí)現(xiàn)這種“級(jí)聯(lián)式”的靶向策略提供了便利。腫瘤細(xì)胞外微環(huán)境中存在基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的過(guò)量表達(dá),可以作為T(mén)DDS的一個(gè)智能化調(diào)節(jié)因子,用于改變TDDS的結(jié)構(gòu)及各種理化性質(zhì),以實(shí)現(xiàn)TDDS特定的功能,如多級(jí)靶向。因此,我們提出通過(guò)葡萄糖配體及MMP2介導(dǎo),實(shí)現(xiàn)級(jí)聯(lián)式腫瘤細(xì)胞及線(xiàn)粒體靶向,破壞線(xiàn)粒體,降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)ATP含量使p-gp失活,從不同角度考慮克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的問(wèn)題。基于此,本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一種GLUT1及MMP2介導(dǎo)的線(xiàn)粒體靶向給藥系統(tǒng),用于克服腫瘤MDR。模型藥紫杉醇通過(guò)GSH敏感二硫鍵偶聯(lián)在PAMAM表面,然后修飾線(xiàn)粒體靶向分子三苯基膦,葡萄糖化的PEG通過(guò)MMP2敏感的多肽(GPLGIAGQ)與 PAMAM 偶聯(lián),制備了 Glucose-PEG-peptide-Triphenylphosponium-PAMAM-Paclitaxel(GPp/TPP/PTXPAMAM)偶聯(lián)物。對(duì)其理化性質(zhì)表征表明,GPp/TPP/PTXPAMAM偶聯(lián)物粒徑在50 nm以?xún)?nèi),在高濃度GSH環(huán)境中釋藥加快,體外釋藥具有GSH敏感性;粒徑在MMP2酶解作用下減小,表明有MMP2敏感性,同時(shí),通過(guò)HPLC對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析,證明酶敏感性的原因是由于MMP2敏感多肽GPLGIAGQ的降解;在腫瘤細(xì)胞及腫瘤球模型上進(jìn)行的細(xì)胞攝取、細(xì)胞定位及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明其具有GLUT1及線(xiàn)粒體靶向性,更強(qiáng)的細(xì)胞毒性,同時(shí)腫瘤細(xì)胞耐藥指數(shù)顯著降低;通過(guò)線(xiàn)粒體膜電位和ATP含量測(cè)定,揭示其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制可能為線(xiàn)粒體膜電位和胞內(nèi)ATP含量的降低導(dǎo)致p-gp活性降低;同時(shí)Western測(cè)定表明,p-gp表達(dá)下調(diào)也是逆轉(zhuǎn)MDR的重要因素;在荷MCF-7/MDR耐藥乳腺癌裸鼠模型上,活體成像及藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明其有更好的腫瘤靶向性和治療效果,以及更低的全身毒性。綜上所述,本研究根據(jù)抗腫瘤藥缺陷設(shè)計(jì)的兩種針對(duì)GLUT1及腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的TDDS能有效提高抗腫瘤藥的腫瘤靶向性和藥效,并降低毒副作用,是很有潛力的TDDS。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R943
【圖文】：

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)及腫瘤微環(huán)境響應(yīng)新型靶向遞藥系統(tǒng)的研宄血管相比，其內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大，因而允許一定分子量或粒淋巴管的缺失，導(dǎo)致淋巴液回流受阻，從而引起粒子積聚為腫瘤增強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng)（Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ邋ａｎｄ邋動(dòng)ＩＥ向給藥系統(tǒng)（Ｐａｓｓｉｖｅ邋Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋Ｓｙｓｔｅｍ，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向的靶向策略，如脂質(zhì)體、膠束、納米粒及高由于被動(dòng)靶向是基于腫瘤組織生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的靶向，要是粒徑及其在血液中的循環(huán)時(shí)間，理論上粒徑在１００－２００制劑，腫瘤靶向性更好，因此，研究者通過(guò)在ＴＤＤＳ表ｅ邋Ｇｌｙｃｏｌ，邋ＰＥＧ）、透明質(zhì)酸等分子的方式實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)的作用

ＥＰＲ）邋［１９］。被動(dòng)ＩＥ向給藥系統(tǒng)（Ｐａｓｓｉｖｅ邋Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋Ｓｙｓｔｅｍ，ＰＴＤＤＳ）即是逡逑利用ＥＰＲ效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向的靶向策略，如脂質(zhì)體、膠束、納米粒及高分子－藥物偶聯(lián)逡逑物等（圖２），由于被動(dòng)靶向是基于腫瘤組織生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的靶向，因而影響其靶向逡逑能力的因素主要是粒徑及其在血液中的循環(huán)時(shí)間，理論上粒徑在１００－２００邋ｎｍ及循環(huán)時(shí)逡逑間較長(zhǎng)的靶向制劑，腫瘤靶向性更好，因此，研究者通過(guò)在ＴＤＤＳ表面修飾聚乙二醇逡逑（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ邋Ｇｌｙｃｏｌ，邋ＰＥＧ）、透明質(zhì)酸等分子的方式實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)的作用，增加腫瘤革巴逡逑向性邋ｔ２0，２Ｉｌ。逡逑曬幕＿丨0．？丨丨丨邋Ｉ逡逑腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞逡逑ＴＤＤＳ逡逑0邋0邋廣｜＿ｉｉｉ！ｉｉＰｒｙ邋腫瘤組織逡逑圖１邋ＥＰＲ效應(yīng)原理示意圖逡逑

本文編號(hào)：2804392