【摘要】：腫瘤的治療是當今社會面臨的重大課題�；熢谀[瘤的治療中占主導(dǎo)地位,但是化療藥物一方面存在溶解性差、生物利用度低及副作用大的缺點;另一方面,由于腫瘤細胞多藥耐藥現(xiàn)象的存在,最終導(dǎo)致化療失敗。腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)(targeted drug delivery system,TDDS),能夠顯著提高藥物溶解度及生物利用度,通過EPR效應(yīng)增強在腫瘤組織的分布,并進一步通過修飾配體的作用,與腫瘤細胞過表達的受體特異性結(jié)合,增加腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度,增強療效,降低毒副作用。但是,目前TDDS仍然存在腫瘤靶向性不高,療效提高有限等缺陷。與正常細胞相比,腫瘤細胞代謝活性顯著增強,其增強的糖酵解速率需要攝取大量的葡萄糖來進行補償,因而,腫瘤細胞表面存在葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT)的過表達。與受體介導(dǎo)的細胞攝取相比,轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的細胞攝取有更快的轉(zhuǎn)運速率以及更高的特異性,因此,葡糖糖轉(zhuǎn)運體是很有潛力的用于腫瘤細胞靶向遞藥的靶點,然而,目前基于GLUT為靶點的TDDS研究還不多。腫瘤細胞賴以生存的胞內(nèi)外微環(huán)境與正常細胞也有顯著差別,腫瘤細胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)濃度比正常細胞高4倍以上,比胞外GSH濃度高5000倍以上,這種GSH分布的巨大差別可以用來實現(xiàn)TDDS在腫瘤細胞內(nèi)的可控化釋藥,實現(xiàn)胞內(nèi)藥物濃度的最大化,增強藥物對腫瘤細胞作用,并降低對正常組織毒性。以往的研究通過GSH敏感鍵交聯(lián)聚合物制備TDDS,雖然能夠?qū)崿F(xiàn)GSH敏感釋藥的目的,但是往往需要復(fù)雜的設(shè)計及制備過程,從為數(shù)不多TDDS的成功案例分析,除了安全性和有效性外,靶向制劑制備過程的簡便化和經(jīng)濟化也是其能否成功向臨床進行轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。基于此,本研究首先設(shè)計了一種安全有效且制備簡便的GLUT1靶向及GSH還原敏感釋藥的高分子-藥物偶聯(lián)物TDDS,該系統(tǒng)以聚酰胺-胺樹枝狀聚合物(PAMAM)為載體,以GLUT1底物D-葡萄糖(D-glucose)為特異性靶向配體,通過聚乙二醇(PEG)與PAMAM進行偶聯(lián),喜樹堿(CPT)為模型藥,通過GSH敏感的二硫鍵連接在PAMAM上,最終合成了 Glucose-PEG-PAMAM-s-s-CPT(GPCC)偶聯(lián)物。其粒徑為20nm,在體外高濃度GSH環(huán)境中釋藥遠遠快于正常生理環(huán)境,具有GSH還原敏感性;在2D腫瘤細胞及3D腫瘤球模型中,與對照組相比,GLUT1高表達的HepG2細胞對GPCC偶聯(lián)物的攝取增強,而GLUT1低表達的L02細胞則沒有顯著性差異(p0.05);GPCC偶聯(lián)物與未修飾D-葡萄糖的偶聯(lián)物相比,細胞毒性更強,細胞周期分析顯示GPCC偶聯(lián)物具有更高的S期阻滯率,細胞凋亡分析顯示GPCC偶聯(lián)物對細胞凋亡誘導(dǎo)率更高;藥代動力學實驗表明GPCC具有更大的最大血藥濃度(Cmax)、更長的循環(huán)時間(t1/2增加),且生物利用度增加(AUC增加);在荷H22肝瘤小鼠模型上,體內(nèi)外活體成像表明,GPCC偶聯(lián)物在腫瘤部位聚集增加,具有明顯的腫瘤靶向性;藥效學實驗表明GPCC能顯著抑制腫瘤生長,具有更好的藥效,但是體重減少最小,結(jié)合HE染色證明其對肝腎正常組織的毒性較小。腫瘤細胞多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的另外一個重要原因,腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象的原因與外排型轉(zhuǎn)運體p-gp的表達增多密切相關(guān),目前針對p-gp進行克服腫瘤MDR研究的策略主要有:藥物包裹于TDDS中避免被p-gp外排;藥物共遞送系統(tǒng),如小分子抗腫瘤藥/大分子基因、化療敏感劑/小分子抗腫瘤藥、抗腫瘤藥/細胞耐藥抑制劑等;線粒體靶向促進細胞凋亡,如線粒體靶向給藥抑制線粒體活性氧的產(chǎn)生、增加線粒體膜通透性、靶向Bcl-2蛋白抑制或下調(diào)細胞抗凋亡作用、靶向遞送治療基因增加促凋亡蛋白Bax和Bak的表達等。p-gp作為ATP依賴型轉(zhuǎn)運體,在轉(zhuǎn)運底物時需要消耗ATP,而線粒體是細胞的“能量工廠”,通過線粒體靶向,破壞線粒體功能,可切斷p-gp的ATP供應(yīng),使p-gp活性降低,進而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥現(xiàn)象,目前通過切斷p-gp能量供應(yīng)克服多藥耐藥的研究還不多。此外,由于線粒體靶向通常對腫瘤細胞及正常細胞沒有選擇性,容易導(dǎo)致嚴重副作用,因而首先實現(xiàn)腫瘤細胞靶向,進一步實現(xiàn)線粒體靶向是較優(yōu)的選擇,腫瘤組織獨特的微環(huán)境為實現(xiàn)這種“級聯(lián)式”的靶向策略提供了便利。腫瘤細胞外微環(huán)境中存在基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的過量表達,可以作為TDDS的一個智能化調(diào)節(jié)因子,用于改變TDDS的結(jié)構(gòu)及各種理化性質(zhì),以實現(xiàn)TDDS特定的功能,如多級靶向。因此,我們提出通過葡萄糖配體及MMP2介導(dǎo),實現(xiàn)級聯(lián)式腫瘤細胞及線粒體靶向,破壞線粒體,降低腫瘤細胞內(nèi)ATP含量使p-gp失活,從不同角度考慮克服腫瘤細胞多藥耐藥的問題。基于此,本研究進一步設(shè)計了一種GLUT1及MMP2介導(dǎo)的線粒體靶向給藥系統(tǒng),用于克服腫瘤MDR。模型藥紫杉醇通過GSH敏感二硫鍵偶聯(lián)在PAMAM表面,然后修飾線粒體靶向分子三苯基膦,葡萄糖化的PEG通過MMP2敏感的多肽(GPLGIAGQ)與 PAMAM 偶聯(lián),制備了 Glucose-PEG-peptide-Triphenylphosponium-PAMAM-Paclitaxel(GPp/TPP/PTXPAMAM)偶聯(lián)物。對其理化性質(zhì)表征表明,GPp/TPP/PTXPAMAM偶聯(lián)物粒徑在50 nm以內(nèi),在高濃度GSH環(huán)境中釋藥加快,體外釋藥具有GSH敏感性;粒徑在MMP2酶解作用下減小,表明有MMP2敏感性,同時,通過HPLC對酶解產(chǎn)物進行了定性分析,證明酶敏感性的原因是由于MMP2敏感多肽GPLGIAGQ的降解;在腫瘤細胞及腫瘤球模型上進行的細胞攝取、細胞定位及細胞毒性實驗表明其具有GLUT1及線粒體靶向性,更強的細胞毒性,同時腫瘤細胞耐藥指數(shù)顯著降低;通過線粒體膜電位和ATP含量測定,揭示其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機制可能為線粒體膜電位和胞內(nèi)ATP含量的降低導(dǎo)致p-gp活性降低;同時Western測定表明,p-gp表達下調(diào)也是逆轉(zhuǎn)MDR的重要因素;在荷MCF-7/MDR耐藥乳腺癌裸鼠模型上,活體成像及藥效學實驗證明其有更好的腫瘤靶向性和治療效果,以及更低的全身毒性。綜上所述,本研究根據(jù)抗腫瘤藥缺陷設(shè)計的兩種針對GLUT1及腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的TDDS能有效提高抗腫瘤藥的腫瘤靶向性和藥效,并降低毒副作用,是很有潛力的TDDS。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943
【圖文】：

葡萄糖轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)及腫瘤微環(huán)境響應(yīng)新型靶向遞藥系統(tǒng)的研宄血管相比，其內(nèi)皮細胞間隙增大，因而允許一定分子量或粒淋巴管的缺失，導(dǎo)致淋巴液回流受阻，從而引起粒子積聚為腫瘤增強的滲透和滯留效應(yīng)（Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ邋ａｎｄ邋動ＩＥ向給藥系統(tǒng)（Ｐａｓｓｉｖｅ邋Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋Ｓｙｓｔｅｍ，實現(xiàn)腫瘤靶向的靶向策略，如脂質(zhì)體、膠束、納米粒及高由于被動靶向是基于腫瘤組織生理結(jié)構(gòu)特點實現(xiàn)的靶向，要是粒徑及其在血液中的循環(huán)時間，理論上粒徑在１００－２００制劑，腫瘤靶向性更好，因此，研究者通過在ＴＤＤＳ表ｅ邋Ｇｌｙｃｏｌ，邋ＰＥＧ）、透明質(zhì)酸等分子的方式實現(xiàn)長循環(huán)的作用

ＥＰＲ）邋［１９］。被動ＩＥ向給藥系統(tǒng)（Ｐａｓｓｉｖｅ邋Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋Ｓｙｓｔｅｍ，ＰＴＤＤＳ）即是逡逑利用ＥＰＲ效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤靶向的靶向策略，如脂質(zhì)體、膠束、納米粒及高分子－藥物偶聯(lián)逡逑物等（圖２），由于被動靶向是基于腫瘤組織生理結(jié)構(gòu)特點實現(xiàn)的靶向，因而影響其靶向逡逑能力的因素主要是粒徑及其在血液中的循環(huán)時間，理論上粒徑在１００－２００邋ｎｍ及循環(huán)時逡逑間較長的靶向制劑，腫瘤靶向性更好，因此，研究者通過在ＴＤＤＳ表面修飾聚乙二醇逡逑（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ邋Ｇｌｙｃｏｌ，邋ＰＥＧ）、透明質(zhì)酸等分子的方式實現(xiàn)長循環(huán)的作用，增加腫瘤革巴逡逑向性邋ｔ２0，２Ｉｌ。逡逑曬幕＿丨0．？丨丨丨邋Ｉ逡逑腫瘤血管內(nèi)皮細胞逡逑ＴＤＤＳ逡逑0邋0邋廣｜＿ｉｉｉ！ｉｉＰｒｙ邋腫瘤組織逡逑圖１邋ＥＰＲ效應(yīng)原理示意圖逡逑

本文編號：2804392