【摘要】：目的探討胰激肽原酶(pancreatic kallikrein,PK)對他克莫司(tacrolimus,TAC)誘導的大鼠腎臟損傷的保護作用及其機制。方法體內(nèi)實驗:48只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為4組(每組12只),正常對照組(VH):橄欖油lmL/kg/day皮下注射和生理鹽水2mL/kg/day腹腔注射;VH+PK組:橄欖油 lmL/kg/day 皮下注射和 PK7.2u/kg/day 腹腔注射;TAC 組:TAC1.5mg/kg/day 皮下注射和生理鹽水2mL/kg/day腹腔注射;TAC+PK組:TAC1.5mg/kg/day皮下注射和PK7.2u/kg/day腹腔注射,各組給藥共4周。4周后收集各組大鼠24小時尿液,使用全自動尿液分析儀檢測24h尿蛋白(Urinary protein,UPRO);右側(cè)頸內(nèi)靜脈采血,使用全自動生化分析儀檢測血肌酐(Serumcreatinine,Scr)及血尿素氮(Bloodureanitrogen,BUN)及TAC血藥濃度;利用腹腔內(nèi)葡萄糖耐受試驗(Intraperitoneal Glucose tolerance test,IPGTT)檢測大鼠 Omin、30min、60min、90min、120min血糖并根據(jù)各時間點血糖值計算葡萄糖曲線下面積(Area under the curve of glucose,AUCg);使用ELISA法測定各組大鼠血清8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)的表達和尿 8-OHdG 排泄率。采集腎組織標本,常規(guī)石蠟包埋和切片,Masson染色法觀察腎間質(zhì)纖維化程度(Tubulointerstitial fibrosis,TIF);PAS染色觀察腎小球病變;使用電子顯微鏡觀察腎組織的超微結(jié)構變化;使用TUNEL染色法觀察腎組織中的凋亡細胞;利用免疫組化法檢測腎組織中腎母細胞瘤蛋白抗體(Wilms Tumorprotein 1,WT-1)、骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、外胚層發(fā)育不良抗體(Ectodermal Dysplasial,ED-1)和錳超氧化物歧化酶(Manganese-containingsu2 peroxidedismutase,MnSOD)。使用免疫印跡法檢測腎組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、MnSOD、白介素 6(Interleukin-6,IL-6)、血紅素氧合酶 1(Hemeoxygenase-1,HO-1)、NADPH 氧化酶 2/4(NADPHOxidase2/4,NOX2/4)、自噬相關因子輕鏈蛋白 3B(Light chainprotein3B,LC3B)、P62、Beclin、Bcl-2 相關 X 蛋白(Bc12-associatedXBax)和 B淋巴細胞瘤-2(B-celllymphoma2,Bcl-2)的表達。體外實驗:體外培養(yǎng)HK-2細胞株,將HK-2細胞分組為對照(Control,CON)組、PK(6pg/mL)組、TAC(50ug/mL)組和 TAC(50ug/mL)+PK(6pg/mL)組每組分別處理時間24h。使用細胞增殖-毒性檢測法(CCK-8)測定各組細胞活力;二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)熒光結(jié)合流式細胞法檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生;免疫印跡法檢測Bcl-2、Bax、LC3B和Beclin的表達。結(jié)果體內(nèi)實驗1.與VH組相比,TAC組大鼠的體重明顯降低,24h尿量、24h尿蛋白定量、血肌酐和血尿素氮均升高(均P0.05),與TAC組相比,TAC+PK組大鼠體重增加,24小時尿蛋白定量、血肌酐和血尿素氮均降低(均P0.05)。2.與VH組相比,TAC組糖耐量明顯異常;與TAC組相比,TAC+PK組糖耐量異常改善(均P0.05)。3.與VH組相比,TAC組腎小管損傷明顯,TIF加重;TAC+PK治療組腎小管損傷減輕,TIF減輕,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。4.與VH組相比,TAC組腎小球系膜區(qū)面積擴大,腎組織中WT-1表達降低;與TAC組相比,TAC+PK組小球系膜區(qū)面積縮小,腎組織中WT-1表達升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。5.與VH組相比,電鏡觀察TAC組腎小管及腎小球損傷明顯,而與TAC組比較,TAC+PK組腎組織超微結(jié)構改變有不同程度改善。6.與VH組相比,TAC組的TGF-β1表達明顯升高。與TAC組相比,TAC+PK組TGF-β1表達降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。7.與VH組相比,TAC組的血清和尿8-OHdG含量增加、促氧化因子(NOX2、NOX4)表達增加,抗氧化因子(MnSOD)表達降低;與TAC組相比,血清、尿氧化應激產(chǎn)物8-OHdG降低、TAC+PK組促炎因子(NOX-2、NOX4)表達降低,抗氧化因子(MnSOD)表達增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。8.與VH組相比,TAC組促炎因子(ED-1\OPN\IL-6)表達增加,抗炎因子HO-1表達降低;與TAC組相比,TAC+PK組促炎因子(ED-1\OPN\IL-6)表達降低,抗炎因子HO-1表達增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。9.與VH組相比,TAC組的自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ、P62、Beclin的表達增加;與TAC組相比,TAC+PK組LC3B-Ⅱ、P62、Beclin的表達降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。10.與VH組相比,TAC組的TUNEL陽性細胞數(shù)增加,Bcl-2/Bax 比值降低;與TAC組相比,TAC+PK組TUNEL 陽性細胞數(shù)降低,Bcl-2/Bax 比值升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。體外實驗1.與CON組相比,TAC組HK-2細胞活力降低;與TAC組相比,TAC+PK組HK-2細胞活力增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。2.與CON組相比,TAC組ROS表達增加;與TAC組相比,TAC+PK組ROS表達降低;差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。3.與CON組相比,TAC組細胞自噬增加,LC3B-Ⅱ、Beclin表達增加;與TAC組相比,TAC+PK組LC3B-Ⅱ、Beclin表達降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。4.與CON組相比,TAC組細胞凋亡增加,Bcl-2/Bax 比值降低;與TAC組相比,TAC+PK組Bcl-2/Bax 比值升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。結(jié)論在體內(nèi)及體外實驗中胰激肽原酶對他克莫司誘導腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球損傷具有保護作用,其機制與胰激肽原酶抑制TGF-β1表達、抗氧化應激、抗炎、調(diào)節(jié)自噬、抗凋亡以及降低血糖有關。
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R965
【圖文】：

圖２各組大鼠ＡＵＣｇ的比較逡逑ＶＨ正常組；ＰＫ胰激肽原酶；ＴＡＣ他克莫司逡逑

圖３．Ｂ各組大鼠腎組織ＴＩＦ程度比較逡逑

圖４．Ｂ各組腎小球系膜區(qū)面積比較逡逑ＶＨ正常組；ＰＫ胰激肽原酶；ＴＡＣ他克莫司逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2803973