【摘要】：目的研究抗菌肽17BIPHE2對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用,并探討其作用機(jī)制。方法1.利用MTT法檢測(cè)不同濃度17BIPHE2(0-40μmol2L~(-1))及陰性對(duì)照肽RL-10對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞和肺上皮BEAS-2B細(xì)胞的細(xì)胞毒性;并確定其IC_(50);2.利用流式細(xì)胞術(shù),Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)17BIPHE2處理后對(duì)A549細(xì)胞周期,細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響;3.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度17BIPHE2處理后A549細(xì)胞凋亡率,TUNEL染色和透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況;4.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗菌肽17BIPHE2處理A549細(xì)胞后線粒體膜電位(△Ψm)、鈣離子和活性氧(ROS)的變化情況;5.Western blot檢測(cè)抗菌肽17BIPHE2作用A549細(xì)胞后,ERK、p-ERK、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)變化情況;6.采用siERK轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,并分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡率以及ERK、p-ERK、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況;7.構(gòu)建肺腺癌裸鼠移植瘤模型,觀察不同劑量抗菌肽17BIPHE2對(duì)小鼠移植瘤的作用;TUNEL染色和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)移植瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡情況和Ki67的表達(dá)。結(jié)果1.抗菌肽17BIPHE2可抑制A549增殖,其24h半數(shù)抑制濃度(IC_(50))為34.33μmol2L~(-1);抗菌肽17BIPHE2對(duì)正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞增殖無(wú)影響。2.經(jīng)0、25、35μmol2L~(-1)抗菌肽17BIPHE2處理A549細(xì)胞24h,A549細(xì)胞周期被阻滯于S期(P0.05);遷移、侵襲能力被有效地抑制;3.經(jīng)不同濃度抗菌肽17BIPHE2(0、25、35μmol2L~(-1))處理A549細(xì)胞24h,TUNEL染色可見(jiàn)細(xì)胞核固縮斷裂呈塊狀,染色質(zhì)致密深染。隨著17BIPHE2濃度的升高,處理組細(xì)胞凋亡的比例明顯提高(P0.05)。在透射電子顯微鏡下可見(jiàn),對(duì)照組A549細(xì)胞,胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰,有大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和線粒體,細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布,核仁結(jié)構(gòu)清晰;而抗菌肽處理組A549細(xì)胞,胞質(zhì)內(nèi)空泡增多,細(xì)胞核皺縮,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)被破壞,線粒體嵴斷裂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹變空。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,處理組A549細(xì)胞凋亡率明顯升高(P0.05)。4.不同濃度(0、25、35μmol·L~(-1))抗菌肽17BIPHE2處理A549細(xì)胞后,A549細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm)明顯降低,細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)明顯升高(P0.05);5.不同濃度(0、25、35μmol·L~(-1))抗菌肽17BIPHE2處理A549細(xì)胞24 h后,western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ERK、Bcl-2表達(dá)下調(diào),p-ERK、Bax表達(dá)上調(diào),Bax/Bcl-2的比值增大(P0.05)。6.siERK轉(zhuǎn)染A549后,經(jīng)0、35μmol·L~(-1)的17BIPHE2處理A549細(xì)胞24h,凋亡率明顯下降;ERK、p-ERK、Bax表達(dá)下調(diào),bcl-2表達(dá)上調(diào),Bax/Bcl-2的比值減小(P0.05)。7.移植瘤內(nèi)注射不同濃度抗菌肽17BIPHE2(0、10、20mg/kg),連續(xù)2周,隔日注射。17BIPHE2治療組與未治療組相比,瘤體積明顯減小,瘤組織內(nèi)癌細(xì)胞凋亡率明顯升高,ki67的表達(dá)量下調(diào)。結(jié)論1.抗菌肽17BIPHE2可通過(guò)抑制肺腺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲,阻滯A549細(xì)胞的細(xì)胞周期,促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。2.抗菌肽17BIPHE2可降低肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位(△Ψm),使A549細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、鈣離子(Ca~(2+))升高,從而激活ERK,通過(guò)ERK調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá),誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2798653